[發明專利]一種載TGF-β3的緩釋組織工程滑膜鞘

有效

• 申請號: 201310161098.4
• 申請日: 2013-05-03
• 公開（公告）號: CN103239759A
• 公開（公告）日: 2013-08-14
• 發明（設計）人: 熊雁;蔣科;王愛民;張正治;王子明;鐘菁
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學第三附屬醫院
• 主分類號: A61L27/54
• 分類號: A61L27/54;A61L27/20;A61L27/38
• 代理公司: 重慶市前沿專利事務所(普通合伙) 50211
• 代理人: 郭云

1.一種載TGF-β3的緩釋組織工程滑膜鞘，其特征在于：支架由致密層(1)和多孔層(2)兩層組成，所述多孔層(2)呈網孔狀，該多孔層(2)內載有含TGF-β3的殼聚糖微球以及滑膜細胞。

2.根據權利要求1所述一種載TGF-β3的緩釋組織工程滑膜鞘，其特征在于：按照如下步驟制備：

a、所述致密層(1)的形成

將殼聚糖溶于2％的醋酸水溶液中，配制成1.5％的殼聚糖溶液，然后在4℃下離心5min，去除雜質，靜置除氣泡后待用；將3.0ml上述溶液澆入直徑9cm的培養皿中，室溫放置24h自然晾干形成致密層(1)；

b、多孔層(2)的形成

再將6ml?1.5％的殼聚糖溶液傾入放置致密層(1)的培養皿中，-20℃預凍2h后冷凍干燥形成多孔層(2)，得到殼聚糖不對稱膜；

c、含TGF-β3的殼聚糖微球的制備

將殼聚糖120mg溶于2％的醋酸水溶液中，磁力攪拌，配成2％的殼聚糖溶液；在該殼聚糖溶液中加入0.1mg/ml的TGF-β3溶液5ug，攪拌混勻，靜置除氣泡后待用；在燒杯中加入80ml液體石蠟，調整攪拌速度至1000rpm，滴加乳化劑Span-80?4ml；用無菌注射器將含TGF-β3的殼聚糖溶液緩慢逐滴加至液體石蠟中，攪拌乳化至顏色呈均一穩定乳白色；加入0.4ml的50％戊二醛溶液與殼聚糖攪拌固化30分鐘，靜置固化30分鐘，淡黃色微球沉淀于杯底；傾去上層油相，用石油醚反復清洗微球，倒去上層石油醚，將下層微球室溫放置揮發30分鐘，得含TGF-β3的殼聚糖微球；

d、載TGF-β3的緩釋組織工程膜制備：

將步驟(b)中得到的殼聚糖不對稱膜裁成直徑為1cm的圓片，準確稱量含TGF-β3的殼聚糖微球5mg，移液槍吹打分散懸于100ul的PBS溶液中，吸取含懸浮微球的PBS溶液，加入殼聚糖膜多孔層(2)，使微球均勻吸附到殼聚糖膜多孔層的孔隙中得到載TGF-β3的殼聚糖緩釋膜；

e、TGF-β3緩釋組織工程滑膜鞘的制備

在無菌條件下取新西蘭白兔膝關節滑膜組織，用無菌PBS溶液清洗三遍組織塊后，在超凈工作臺內剪切成碎粒，將碎粒移至10mL離心管內，加入0.1％胰蛋白酶DMEM溶液，震蕩消化30分鐘，1000rpm離心5min，去上清液，加入0.1％的II型膠原酶DMEM溶液，放置于37℃、體積分數為0.05的CO₂的恒溫搖床內消化2h，觀察組織碎片大部分被消化，液體混濁，離心，去上清液；用PBS沖洗1次，100目篩網過濾，收集濾液，離心、去上清液；加入含10％FBS的DMEM培養液5mL，充分吹打均勻后，移至無菌培養皿；放入CO₂恒溫培養箱內培養；每三天換液一次，5～7天傳代；

將滑膜細胞懸液調整濃度為2x10⁵個/mL，用加樣器吸取細胞懸液100ul均勻加入TGF-β3殼聚糖緩釋膜的多孔層中，孵育3h，再向培養孔中加入含10％FBS的DMEM培養液，使得滑膜細胞貼附TGF-β3殼聚糖緩釋膜多孔層生長，將片狀滑膜細胞-TGF-β3殼聚糖緩釋膜復合物包繞于事先消毒好的硅膠管上，使其成管形結構，得到載TGF-β3的緩釋組織工程滑膜鞘。

3.根據權利要求1所述一種載TGF-β3的緩釋組織工程滑膜鞘，其特征在于：所述多孔層(2)厚度為200-300um。