[發明專利]一種含有降解苯并[a]蒽功能基因的降解質粒

無效

• 申請號: 201310159911.4
• 申請日: 2013-04-26
• 公開（公告）號: CN103232999A
• 公開（公告）日: 2013-08-07
• 發明（設計）人: 豆俊峰;王營營;丁愛中;謝恩;杜勇超
• 申請（專利權）人: 北京師范大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12R1/01
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種含有降解苯并[a]蒽功能基因的降解質粒，其特征在于，該降解質粒由菌株Stenotrophomonas?acidaminiphila的菌液經過提取與純化得到的，菌株Stenotrophomonas?acidaminiphila的菌種保藏號為CGMCC?No.3683，其中，從菌株Stenotrophomonas?acidaminiphila中提取與純化含有降解苯并[a]蒽功能基因的降解質粒的具體方案為：

(1)向體積為500mL的錐形瓶內加入400mL基礎培養基、1.0mL微量金屬液、0.1mL維生素c溶液，搖勻后作為液體培養基備用；其中基礎培養基的組成為：NH₄NO₃：1.7g·L^-1，KH₂PO₄：1.0g·L^-1，K.₂HPO₄：1.0g·L^-1，MgCl₂：0.30g·L^-1，CaCl₂·2H₂O：0.15g·L^-1；微量金屬液的組成為：CoCl₂·6H₂O：55mg·L^-1，CuCl₂：0.35mg·L^-1，H₃BO₃：11.0mg·L^-1，MnCl₂·4H₂O：45mg·L^-1，Na₂MoO₄·2H₂O：5.5mg·L^-1，NiCl₂·2H₂O：4.5mg·L^-1，ZnCl₂：4.5mg·L^-1；

(2)在超凈工作臺中向體積為100mL的錐形瓶中加入6.0mL濃度為1g/L的苯并[a]蒽丙酮溶液，為除去丙酮將錐形瓶開口放置2天；

(3)向步驟(2)中的錐形瓶內加入60mL按步驟(1)配制的液體培養基；

(4)在超凈工作臺中挑取菌株Stenotrophomonas?acidaminiphila，將其接種至步驟(3)中的錐形瓶中，在溫度為25～30℃、轉速為100r/min的振蕩器中培養20～22天；

(5)將步驟(4)中的菌液轉移到容積為15mL的離心管中，在10000r/min條件下離心10min，棄去上清液；

(6)向步驟(5)中的離心管中加入10mL?pH值為9.0濃度為0.08M的NaH₂PO₄緩沖液，旋渦振蕩5min后再進行超聲波振蕩15min，在10000r/min條件下離心10min，棄去上清液分離出菌體；

(7)向由步驟(6)的離心管中加入7mL溶液A，然后混勻；溶液A的組成為：50mL0.45M三羥基甲基氨基甲烷-HCl，20mL0.25M?EDTA，20mL0.9M?KCl，10mL百分比濃度為2.0％的氯化十六烷基三甲胺，pH8.2；然后加入2.2mg?N-乙酰胞壁質聚糖水解酶，在0～4℃條件下振蕩10min后加入1.5mL濃度為50g/L的乙氧基化烷基硫酸鈉溶液，旋渦振蕩5min后在55℃條件下水浴振蕩1h，在10000r/min條件下離心10min，收集上清液；

(8)向由步驟(7)得到的上清液中加入1mL濃度為5.5M的醋酸鉀和0.5mL異丙醇，在0～4℃條件下振蕩15min，在10000r/min條件下離心10min，收集上清液；

(9)將由步驟(8)得到的上清液加入到離心純化柱上，將離心純化柱放入離心管中，在10000r/min條件下離心10min，倒去離心管中的液體；重復這一過程，直至所有由步驟(8)得到的上清液都經過離心純化柱純化；

(10)向經步驟(9)處理后的離心純化柱中加入0.5mL溶液B，溶液B的組成為：5mL4.5M鹽酸胍，10mL3.5M醋酸鉀與85mL無水乙醇，pH7.0；在0～4℃條件下振蕩15min，在10000r/min條件下離心5min，倒去離心管中的液體；

(11)向經步驟(10)處理后的離心純化柱中加入0.6mL溶液C，溶液C的組成為：40mL10mM三羥基甲基氨基甲烷-HCl，30mL3.0M?NaCl，30mL1.5mM?EDTA，pH8.5；在55℃條件下振蕩20min，在10000r/min條件下離心5min；將離心管中的液體重新加入到該離心純化柱中，在55℃水浴中放置10min，在10000r/min條件下離心5min；離心管中液體即為含有降解苯并[a]蒽功能基因的降解質粒溶液，在-20℃保存備用。