[發明專利]PON-1活性檢測試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請號: 201310156905.3
• 申請日: 2013-04-30
• 公開（公告）號: CN103233061A
• 公開（公告）日: 2013-08-07
• 發明（設計）人: 王連升;張建華
• 申請（專利權）人: 王連升;張建華
• 主分類號: C12Q1/44
• 分類號: C12Q1/44;C07F9/12
• 代理公司: 上海申蒙商標專利代理有限公司 31214
• 代理人: 陳曉華

技術領域

本發明屬于心血管疾病的臨床診斷技術領域，具體涉及一種以對硝基苯磷酸二乙酯為底物的PON-1活性檢測試劑盒及其檢測方法，適用于生化分析儀體外定量測定人血清等體液中PON-1的活性，作輔助診斷用。

背景技術

心血管疾病，又稱為循環系統疾病，主要包括：心臟病、低血壓、高血壓、高血糖癥、中風、心肌梗死、血栓、動脈硬化等，其病理基礎是動脈粥樣硬化。對于心血管疾病的預防和早期診斷是近年來醫學界研究的重點之一。

目前臨床上常通過測定血清中甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、脂蛋白a（Lp-a）、載脂蛋白B100（Apo?B100）、載脂蛋白AI（Apo?AI）、肌酸激酶（CK）、磷酸肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌鈣蛋白（cTnT和cTnI）、α-羥丁酸脫氫酶等的濃度作為評價心血管功能的指標。但是此類方法存在一個明顯的缺點：這些指標參數只有在心血管組織嚴重受損的時候，才能比較客觀的反應心血管功能，并且存在誤診的可能性，而在早期心血管疾病中，這些指標不能及時反映心血管功能的微妙變化。心血管疾病的臨床表現遲于病理出現，因此當血脂和心肌酶指標明顯升高時，心血管組織已經出現了嚴重的損傷，并且可能發張為冠心病、心肌梗死甚至是死亡。因此，尋找心血管疾病早期診斷標志物并且開發相應的檢測試劑及方法就有極其重要的意義了。

對氧磷酶(paraoxonase,?PON)是一類能催化水解磷酸酯鍵的芳香酯酶，主要由肝臟分泌，在哺乳動物體內廣泛分布于許多組織，如肝臟、血液、腎臟、脾臟及腦組織等。PON分子量為43000～45000道爾頓，主要由肝臟分泌的，它廣泛分布于體內各組織中，包括肝臟、血液、腦組織等。PON基因家族至少有3個成員，包括PON-1、PON-2和PON-3。大多數研究表明，各種原因引起的心血管疾病，血清中PON-1的活性會相應降低，其濃度和活性與心腦血管疾病密切相關,?是心腦血管疾病的危險因子。可見PON-1對于心血管疾病是一種簡便易行并且敏感性較高的指標，因此可以作為各類心血管疾病早期診斷、危險度評估及臨床監測的新指標。

目前國內外血清PON測定的方法主要有：比色法、紫外分光光度法、熒光法、放射免疫法、終點顯色法、固定時間兩點法、連續監測法等等。其中比色法和紫外分光光度法應用最為廣泛。

比色法是依據1988年Furlong等人建立的一種以paraoxon為底物來測定血清中PON-1的方法，通過比較或測量空白液及測定液的光密度差值，用摩爾消光系數計算出單位時間內每毫升血清中PON-1將paraoxon轉變成產物的量，得出血清PON-1的濃度及活性，是一種經典的、成熟的測定方法，廣泛被運用于臨床生化實驗室中。但是由于paraoxon底物水解釋放出的色源接近血清的顏色，測定時會對數據產生影響，需要扣除本底；另一方面，從測量的準確度、靈敏度和應用范圍上，比色法都不如紫外分光光度法，該法在測定低活性的PON-1時其誤差較大，需通過增加血清樣本體積來達到靈敏度上的檢測要求。

紫外-可見分光光度法是根據物質分子對波長為200-760nm這一范圍的電磁波的吸收特性所建立起來的一種定性、定量和結構分析方法。PON在體內的天然底物尚不清楚，目前各實驗室常用對氧磷或乙酸苯酯作底物測定PON活性。乙酸苯酯在PON的催化下生成乙酸和苯酚。根據苯酚對270?nm紫外光有強烈吸收而乙酸苯酯吸收極低這一性質，可通過酶促反應后270?nm吸光度的增加值來檢測PON活性的高低。

熒光法利用某些物質被紫外光照射后所發生的能反映出該物質特性的熒光，可以進行定性或定量分析的方法；放射免疫法利用同位素標記，通過觀察不同抗原同抗體發生競爭性抑制反應，研究物質在機體內的發展和轉化規律；連續監測法通過測定尿樣、血樣單位時間內吸光度的變化，推斷、計算酶活性的變化；顯色法利用物質與試劑反應產生的顯色反應推斷、計算酶的活性。

綜合各種方法，各有各的應用條件與對應底物，各有優劣。因此本領域迫切需要一種可以方便普通醫務人員使用、易于長期保存、檢測精度較高的PON-1活性檢測試劑盒及其檢測方法。

發明內容

本發明的目的是根據上述現有技術的不足之處，提供一種PON-1活性檢測及其檢測方法，該試劑盒通過配制甘氨酸-NaOH緩沖液和對硝基苯磷酸二乙酯底物液，將兩者混勻并加入一定量的血清樣本，血清樣本中的PON-1水解對硝基苯磷酸二乙酯的磷酸鍵，游離出色源對硝基酚，通過測定對硝基酚在405nm處吸光度的增加可求得PON-1的活性和濃度。