[發(fā)明專利]一種放線菌纖溶酶及其制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310156073.5
• 申請日: 2013-05-02
• 公開（公告）號: CN103333874A
• 公開（公告）日: 2013-10-02
• 發(fā)明（設計）人: 鄧永平;劉曉蘭;鄭喜群;艾瑞波
• 申請（專利權(quán)）人: 齊齊哈爾大學
• 主分類號: C12N9/68
• 分類號: C12N9/68;C12R1/01
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領域

本發(fā)明涉及一種放線菌纖溶酶，本發(fā)明還涉及一種該纖溶酶的培制方法。

背景技術(shù)

血栓栓塞類疾病嚴重危害人類生命和健康，溶栓法目前是治療和預防血栓性疾病的主要手段，研制高效、快速、防止再栓塞并能降低出血等不良反應的新型溶栓藥物是現(xiàn)代醫(yī)學的迫切需要。

纖溶酶具有溶解血纖維蛋白的功能，血纖維蛋白是構(gòu)成血栓的主要成分，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)纖溶酶具有生產(chǎn)周期短，占地面積小，產(chǎn)物含量高等優(yōu)點。因此，研制高效、特異性強的微生物纖溶酶是生產(chǎn)新型溶栓藥物的主要方式。

近十年的時間里，本申請人一直在探索微生物在現(xiàn)代生物溶栓劑制備中的應用潛力，分別于2006年、2010年成功地培制出了專利申請?zhí)枮?00610163497.6?和?200810137564.4的兩種微生物纖溶酶，這兩種纖溶酶培養(yǎng)所使用的菌種都是真菌，真菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物較多，導致纖溶酶的后續(xù)分離純化步驟較多，過多的分離純化步驟會降低纖溶酶的活力，導致纖溶效果下降，因此，近年來本申請人一直在努力尋找發(fā)酵代謝產(chǎn)物種類較少，易于產(chǎn)物分離純化的優(yōu)良產(chǎn)酶菌種，本發(fā)明就是該項研究進展的部分內(nèi)容。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的發(fā)明目的在于提供一種放線菌纖溶酶，該纖溶酶不僅具有很好的溶栓性能，還對大腸桿菌具有較好的抑菌性，相對分子量小，易于人體吸收。本發(fā)明的另一個發(fā)明目的還在于提供一種該纖溶酶的培制方法。

本發(fā)明產(chǎn)品是以保藏號為CGMCC?No.5816，其分類學命名為放線菌Actinomycete?sp.的放線菌YY21菌株為菌種，經(jīng)過斜面培養(yǎng)、平板培養(yǎng)、液體發(fā)酵培養(yǎng)、分離和提純，最后培制出本發(fā)明的纖溶酶產(chǎn)品。

經(jīng)過Q-TOF2串聯(lián)質(zhì)譜鑒定此放線菌纖溶酶為新型蛋白質(zhì)，測得其中五個肽段序列分別為：A-Q-S-V-P-Y-G-L-S-Q-L-K，其分子量為1289.6644；V-A-V-L-D-S-G-L-D-S-S-H-P-D-L-K，其分子量為1651.8243；N-S-L-E-S-T-A-T-N-L-G-N-P-A-G-A-T-Y-G-K，其分子量為1964.8844；h-p-n-w-T-n-t-n-v-r，其分子量為1237.5844；Y-P-S-V-L-A-V-G-A-V-D-N-G-V-S-N-K，其分子量為1688.8043。

本發(fā)明產(chǎn)品制備的具體步驟：

1、以放線菌菌株YY21為菌種，經(jīng)過斜面培養(yǎng)、液體發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)放線菌纖溶酶；

2、培養(yǎng)方法：斜面培養(yǎng)→種子培養(yǎng)→發(fā)酵培養(yǎng)；

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖0.4-0.5%，酵母膏0.3-0.6%，麥芽浸膏0.5-1.5%，碳酸鈣0.1-0.2%，瓊脂1.5%，pH6-7，28℃培養(yǎng)4-7d。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖0.4-0.5%，酵母膏0.3-0.6%，麥芽浸膏0.5-1.5%，碳酸鈣0.1-0.2%，調(diào)節(jié)pH為6-7，接種后170-190r/min，28℃培養(yǎng)28-32h。

發(fā)酵培養(yǎng)基組：小米粉6-8%，葡萄糖2-4%，碳酸鈣0.1-0.3%，氯化鈉0.4-0.6%，蛋白胨0.6-0.7%，pH7.0-7.4，5%接種量，150-170r/min，22℃發(fā)酵90-100h。

3、粗提純放線菌纖溶酶：將液體發(fā)酵培養(yǎng)物10000rpm/min、4℃、離心20?min，離心上清液經(jīng)30%-60%W/V飽和度的硫酸銨分級鹽析后為粗酶液。

4、精提純放線菌纖溶酶：采用現(xiàn)代色譜技術(shù)對粗酶液進行精提純，

采用以下純化步驟依次進行：

a、Octyl-Sepharose?FF疏水相互作用層析，將樣品鹽飽和度調(diào)到30％，上樣后用30～0％W/V硫酸銨溶液梯度洗脫，收集有纖溶活性組分；和

b、Phenyl-Sepharose?HP疏水相互作用層析，將樣品鹽飽和度調(diào)到15％，上樣后用15～0％W/V硫酸銨溶液梯度洗脫，收集有纖溶活性組分。