[發(fā)明專(zhuān)利]綿羊FGF5基因定點(diǎn)敲除系統(tǒng)及其應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310155501.2
• 申請(qǐng)日: 2013-04-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103289974A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-09-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 皮文輝;周平;楊華;楊永林;甘尚權(quán);梁龍;王新華;劉守仁
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 新疆農(nóng)墾科學(xué)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/22
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/22;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10
• 代理公司: 北京鼎佳達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11348
• 代理人: 王偉鋒;劉鐵生

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)中的基因敲除技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是涉及一種綿羊FGF5基因定點(diǎn)敲除系統(tǒng)及其在綿羊FGF5基因ATG位點(diǎn)敲除中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)子(transcription?activator-like?effector,TALE)來(lái)源于黃單胞桿菌(Xanthomonas?sp.)，TALE-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域由串聯(lián)重復(fù)單元組成，大部分單元含34（33～35）個(gè)氨基酸，單元的第12和13位氨基酸高度可變，稱(chēng)為重復(fù)可變區(qū)（repeat?variable?diresidues,RVDs）。TALE的RVDs識(shí)別DNA序列的4個(gè)堿基具有高度的專(zhuān)一性，TALE重復(fù)單元的第13位氨基酸直接與DNA的堿基特異結(jié)合。研究者幾乎能夠針對(duì)任何DNA靶序列，構(gòu)建特異性TALE-DNA結(jié)合域，在靶向改變基因序列和調(diào)控基因表達(dá)方面具有廣泛的用途。

設(shè)定DNA靶序列，組裝TALE-DNA結(jié)合域，融合Fok?I內(nèi)切酶的非特異性DNA切割域，組裝成TALE核酸酶(tanscription?activator-like?effector?nucleases,TALENs)。TALENs靶向結(jié)合DNA，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂（DNA?double-srand?breaks,DSBs）。在真核細(xì)胞內(nèi)，DSBs激活兩條保守的DNA修復(fù)通路。非同源末端連接修復(fù)(non-homologous?end?joining，NHEJ)能夠?qū)嗔训娜旧w重新連接，在斷裂位點(diǎn)引進(jìn)小片段插入或刪除，影響基因功能或產(chǎn)生基因敲除效應(yīng)。同源指導(dǎo)修復(fù)（homology-directed?repair，HDR）能夠用相似序列的DNA供體模板，代替斷裂點(diǎn)周?chē)腄NA序列，交換DNA序列，實(shí)現(xiàn)特定突變或?qū)胪庠碊NA序列。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種綿羊FGF5基因定點(diǎn)敲除系統(tǒng)及其在綿羊FGF5基因ATG位點(diǎn)敲除中的應(yīng)用。

本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)綿羊FGF5基因是指綿羊成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子5（fibroblast?growth?factor5）基因。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

綿羊FGF5基因定點(diǎn)敲除系統(tǒng)，所述定點(diǎn)敲除系統(tǒng)為剪切綿羊FGF5基因靶序列的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶TALEN；

所述綿羊FGF5基因靶序列如SEQ?ID?NO.1所示核苷酸序列，12-30位核苷酸為識(shí)別模塊TALFGF5F、與51-69位核苷酸互補(bǔ)的序列為識(shí)別模塊TALFGF5R，31-50位核苷酸為間隔序列；

所述轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶TALEN由剪切所述識(shí)別模塊TALFGF5F的核酸酶TALEN-L和剪切所述識(shí)別模塊TALFGF5R的核酸酶TALEN-R組成；所述核酸酶TALEN-L為SEQ?ID?NO.2或SEQ?ID?NO.3所示核苷酸編碼的蛋白質(zhì)，所述核酸酶TALEN-R為SEQ?ID?NO.4或SEQ?ID?NO.5所示核苷酸編碼的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明還提供上述綿羊FGF5基因定點(diǎn)敲除系統(tǒng)的制備方法，包括步驟：

（1）根據(jù)綿羊FGF5基因選擇SEQ?ID?NO.1所示核苷酸序列為靶序列，SEQ?ID?NO.1所示核苷酸序列中12-30位核苷酸為識(shí)別模塊TALFGF5F、與51-69位核苷酸互補(bǔ)的序列為識(shí)別模塊TALFGF5R，31-50位核苷酸為間隔序列；

（2）根據(jù)步驟（1）所得識(shí)別模塊TALFGF5F和識(shí)別模塊TALFGF5R合成剪切所述靶序列的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶TALEN；所述轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶TALEN由剪切所述識(shí)別模塊TALFGF5F的核酸酶TALEN-L和剪切所述識(shí)別模塊TALFGF5R的核酸酶TALEN-R組成；

所述核酸酶TALEN-L為SEQ?ID?NO.2或SEQ?ID?NO.3所示核苷酸編碼的蛋白質(zhì)，所述核酸酶TALEN-R為SEQ?ID?NO.4或SEQ?ID?NO.5所示核苷酸編碼的蛋白質(zhì)。

含有上述綿羊FGF5基因定點(diǎn)敲除系統(tǒng)編碼基因的重組表達(dá)載體、重組菌或重組細(xì)胞系。

一種定點(diǎn)敲除綿羊FGF5基因的方法，包括在綿羊成纖維細(xì)胞中表達(dá)上述定點(diǎn)敲除系統(tǒng)的步驟。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：