[發(fā)明專利]一種以黑豆為原料制備高活性納豆激酶的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310154402.2
• 申請日: 2013-04-28
• 公開（公告）號: CN103205409A
• 公開（公告）日: 2013-07-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王業(yè)富;高麗
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢真福醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司
• 主分類號: C12N9/56
• 分類號: C12N9/56;C12R1/125
• 代理公司: 武漢科皓知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 張火春

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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以黑豆為原料制備高活性納豆激酶的方法。

背景技術(shù)

黑豆與黃豆均屬于大豆，但黑豆在營養(yǎng)數(shù)量和質(zhì)量上都具有優(yōu)勢。黑豆富含異黃酮和黃酮混合物、大量的食物纖維素、不飽和脂肪酸、豐富的蛋白質(zhì)、多種礦物質(zhì)和微量元素，特別是黑色種皮含有多種色素和皂甙以及獨特的活性物質(zhì)。另外黑豆中含有大量能降低惡性膽固醇的大豆球蛋白、亞油酸以及降低中性脂肪的亞麻酸等，這些有用成分具有軟化血管、擴張血管、促進血液流通的作用，并且具有降血脂、預(yù)防心血管疾病、抗氧化、延緩衰老、增加胃腸蠕動等功效。黑豆在醫(yī)藥工業(yè)中是廉價的重要原料，自古就有“大豆數(shù)種，唯黑入藥”的記載。從黑豆中提取的卵磷脂、大豆異黃酮、皂甙等活性物質(zhì)可預(yù)防和治療心血管疾病、高血壓及癌癥。

心腦血管疾病嚴重威脅著人類的身體健康，是現(xiàn)今僅次于癌癥的第二大病癥，全世界共有血栓病人1500萬，所需的溶栓劑的潛在市場約20億美元。目前常用的及一些還在開發(fā)的治療心腦血管栓塞疾病的藥品均在不同程度上存在一定的缺陷，或者毒性比較強、副作用大，或在體內(nèi)半衰期較短、藥效難以發(fā)揮，或來源緊缺、價格昂貴等，很難成為一種大眾藥品，而納豆激酶卻有望彌補這些缺陷。

由于納豆激酶具有目前市場上正在使用的溶栓藥物所不具有的優(yōu)點，那么提高納豆激酶的單位產(chǎn)物的酶活力和生產(chǎn)效率對納豆激酶的推廣應(yīng)用具有重要的意義。目前納豆激酶的生產(chǎn)方式主要是以發(fā)酵為主。在發(fā)酵方式上有固體發(fā)酵和液體發(fā)酵，固體發(fā)酵具有原料普遍易得、成本低、設(shè)備簡單、產(chǎn)酶活力高等優(yōu)點。目前用固體發(fā)酵方法生產(chǎn)納豆激酶多是用黃豆為原料進行發(fā)酵，存在酶活不高及氨臭味大等缺點。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種以黑豆為原料制備高活性納豆激酶的方法。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種以黑豆為原料制備高活性納豆激酶的方法，包括如下步驟：用特制營養(yǎng)液浸泡黑豆，將浸泡后的黑豆進行蒸煮，再接種納豆菌進行發(fā)酵。

所述的特制營養(yǎng)液包括如下濃度成分：乳糖5-15g/L、胰蛋白胨10-30g/L、Na₂HPO₄·12H₂O?1-10g/L、NaH₂PO₄·2H₂O?0.5-1.5g/L、MgSO₄·7H₂O?0.1-1g/L、CaCl₂?0.1-0.5g/L，pH?7.0-7.5。

優(yōu)選的，所述的特制營養(yǎng)液包括如下濃度成分：乳糖10g/L、胰蛋白胨20g/L、Na₂HPO₄·12H₂O?5g/L、NaH₂PO₄·2H₂O?1g/L、MgSO₄·7H₂O?0.5g/L、CaCl₂?0.2g/L，pH?7.2。

所述的黑豆與特制營養(yǎng)液的質(zhì)量體積比（g/mL）優(yōu)選為1?:?3。

所述的浸泡優(yōu)選為15-25℃浸泡16-20h。

所述的蒸煮優(yōu)選為0.1MPa?、121℃蒸煮30-40min。

所述的接種優(yōu)選為將蒸煮后的黑豆自然冷卻至40-50℃后于無菌條件下按原料（黑豆）重量的10%接種納豆菌種子液；所述的種子液是由斜面菌株經(jīng)搖瓶培養(yǎng)制備；種子培養(yǎng)液及培養(yǎng)條件：以LB培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基，pH為7.2，三角瓶裝液量為25mL/250mL，培養(yǎng)溫度37℃，搖床轉(zhuǎn)速為180r/min，培養(yǎng)周期為16h。

所述的納豆菌為Bacillus?subtilis?QK02，由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC?NO:?M?203078。

所述的發(fā)酵的條件優(yōu)選為溫度37-42℃，濕度75%-85%，物料厚度2-3cm，發(fā)酵時間為24h。

上述以黑豆為原料制備高活性納豆激酶的方法，還包括提取分離和冷凍干燥步驟。

所述的提取分離包括浸提、沉淀、柱層析步驟，具體如下：

（1）浸提：按質(zhì)量體積比（g/mL）1?:?1?的比例往發(fā)酵后的產(chǎn)物加入生理鹽水于4℃浸提12-24h，再于4℃、8000?r/min離心15min，所得上清為發(fā)酵粗酶液；