[發明專利]新型微RNA篩選方法、驗證系統及其應用

有效

• 申請號: 201310153531.X
• 申請日: 2013-04-27
• 公開（公告）號: CN104123480B
• 公開（公告）日: 2017-03-08
• 發明（設計）人: 荊清;李湘麒;李粵
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海生命科學研究院
• 主分類號: G06F19/28
• 分類號: G06F19/28;C12Q1/68;C12N15/113
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司31266
• 代理人: 祝蓮君,雷芳

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種新型微RNA(hetRNA)篩選系統的構建方法及其應用。

背景技術

最近的研究表明，真核基因組90%以上的序列都會被轉錄，產生大量的非編碼RNA(ncRNAs)【Costa?FF.，Bioessays2010;32(7):599-608；Carninci?P,Yasuda?J,Hayashizaki?Y.，Curr?Opin?Cell?Biol2008;20(3):274-280】，包括長的非編碼RNA(lncRNAs)和小的非編碼(sRNAs<200nt)。sRNAs幾乎能直接或間接影響細胞的每一個生物學活動【Czech?B,Hannon?GJ.，Nat?Rev?Genet?2010;12(1):19-31】。自從1993年發現microRNAs(一種sRNA)以來，解析小RNA組學(sRNAome)已經成了很多實驗室的目標【Lee?RC,Feinbaum?RL,Ambros?V.，Cell1993;75(5):843-854】。這導致多種功能性的內源微RNA(<30nt)的發現【Choudhuri?S.，J?Biochem?Mol?Toxicol2010;24(3):195-216.；Taft?RJ,Pang?KC,Mercer?TR,Dinger?M,Mattick?JS.，J?Pathol?2009;220(2):126-139.；Li?Z,Kim?SW,Lin?Y?et?al.，J?Virol2009;83(24):12751-12758.；Taft?RJ,Simons?C,Nahkuri?S?et?al.，Nat?Struct?Mol?Biol;17(8):1030-1034】。但是，這些微RNA一般是連續地存在于對應的基因組上。

最近發展起來的深度測序技術(deep?sequencing)特別適合于發現微RNA【Hafner?M,Landgraf?P,Ludwig?J?et?al.，Methods?2008;44(1):3-12】。深度測序技術可以產生千萬乃至上億的微RNA數據，這使得人們能夠比先前更為詳盡地解析微RNA組學，特別是它能夠發現那些先前克隆和標準的方法無法實現的新的尤其是低豐度的微RNA【Nagalakshmi?U,Waern?K,Snyder?M.，Curr?Protoc?Mol?Biol2010;Chapter4:Unit4?11?11-13.；van?der?Brug?M,Nalls?MA,Cookson?MR.，Brain?Res2010;1338:146-154.】。但是，隨之而來的挑戰是如何確定這百萬級以上的小核苷酸序列在基因組上的定位。事實上，對一般的測序平臺來說，的確有明顯比例的數據是不能在基因組中找到定位的【Blow?N.，Nature2009;458(7235):239-242.】。有趣的是，最近，人們在高通量測序數據中發現一種不連續的小于200nt的小RNA，這種小RNA在基因組上被一個內含子所隔開【Nature2009;457(7232):1028-1032.；Mercer?TR,Dinger?ME,Bracken?CP?et?al.，Genome?Res;20(12):1639-1650.；Valen?E,Preker?P,Andersen?PR?et?al.，Nat?Struct?Mol?Biol;18(9):1075-1082.】。但是，有沒有小于30nt的不連續的微RNA還有待進一步探究。畢竟小于200nt還是很大的分子，也容易與基因組匹配，但小于30nt的分子就很困難了。

綜上所述，本領域對于微RNA的認識還非常有限，迫切需要開發新的鑒別新型微RNA的方法。此外，還需要開發簡單方便快速的技術來進行驗證，以便篩選和鑒別新型的微RNA。

發明內容

本發明的目的就是提供一種鑒別新型微RNA或其前體的方法。

本發明的第一方面，提供了一種構建用于hetRNA篩選的數據庫的方法，所述方法包括：

(a)提供一微小RNA深度測序數據庫(或稱為微RNA垃圾數據庫，或0級RNA篩選庫)，

其中所述微小RNA測序數據庫中的各RNA序列記為RNAj0，其中RNAj0表示序號為j0的RNA序列，j0為1-n0的正整數，n0為所述微小數據庫中的RNA序列總數，并且RNAj0是未能與基因組序列匹配的微小RNA，并且所述微小RNA測序數據庫不包括已驗證或證實的hetRNA和已知小RNA的RNA序列；