[發明專利]增強β-環糊精葡萄糖基轉移酶產β-環糊精能力的突變方法

在審

• 申請號: 201310153385.0
• 申請日: 2013-04-26
• 公開（公告）號: CN103555685A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發明（設計）人: 顧正彪;李兆豐;班宵逢;程力;洪雁;李才明
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/10;C12N15/75;C12R1/09;C12R1/125
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技術領域

增強β-環糊精葡萄糖基轉移酶產β-環糊精能力的突變方法，本發明屬于基因工程和酶工程領域。本發明是利用定點突變方法增強環糊精葡萄糖基轉移酶產物特異性的技術。

背景技術

環糊精是由D-吡喃葡萄糖通過α-1，4-糖苷鍵連接而成，具有環狀中空圓錐形結構，其中以6、7和8個葡萄糖單元所構成的α-、β-和γ-環糊精最為常見。由于具有外親水、內疏水的特性，環糊精能與許多疏水客體分子形成包合物，從而改變客體分子的理化性質，因此，在食品、醫藥等工業領域中有著廣泛的應用。

環糊精的工業化生產均采用酶法工藝，即在環糊精葡萄糖基轉移酶(CGT酶)催化作用下通過環化反應轉化淀粉所合成。由于野生CGT酶作用淀粉所得產物均為α-、β-和γ-環糊精的混合物，給單一類型環糊精產物的分離和純化帶來很多不便。目前，工業上分離β-環糊精的方法通常為選擇性結晶或有機溶劑絡合。

本發明中所使用的來源于環狀芽孢桿菌(Bacillus?circulans)STB01的β-CGT酶主要以生成β-環糊精為主，但環化產物中α-和γ-環糊精仍占有較大比例，因此，進一步提高該酶產β-環糊精的能力，將更加有利于β-環糊精的工業化生產。

發明內容

本發明的目的是提供進一步提高B.circulans?STB01CGT酶產β-環糊精能力的突變方案。

本發明的另一個目的是提出增強β-CGT酶產β-環糊精能力的突變體A31R、A31P和A31T，及其構建方法。

本發明的技術方案：

來源于B.circulans?STB01的CGT酶的三種突變體A31R、A31P和A31T，將CGT酶中第31位丙氨酸分別突變成精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)或蘇氨酸(Thr)，它們相比于野生型CGT酶具有更高的產β-環糊精能力。

所述的三種突變體A31R、A31P和A31T的制備方法，根據B.circulans?STB01CGT酶的基因序列，分別設計并合成引入Arg31、Pro31和Thr31密碼子的突變引物，對基因進行定點突變，測定DNA序列，分別鑒別出Ala31密碼子變成Arg31密碼子，Pro31密碼子及Thr31密碼子的突變基因，并在枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)WB600中進行表達。

(1)定點突變

利用快速PCR技術，以含野生CGT酶基因的表達載體pST/cgt為模板進行定點突變。

引入Arg31密碼子的定點突變引物：

正向引物：5’-GACGGCAATCCCCGCAACAATCC-3’，下劃線為突變堿基，

反向引物：5’-GGATTGTTGCGGGGATTGCCGTC-3’，下劃線為突變堿基；

引入Pro31密碼子的定點突變引物：

正向引物：5’-GACGGCAATCCCCCCAACAATCC-3’，下劃線為突變堿基，

反向引物：5’-GGATTGTTGGGGGGATTGCCGTC-3’，下劃線為突變堿基；

引入Thr31密碼子的定點突變引物：

正向引物：5’-GACGGCAATCCCACCAACAATCC-3’，下劃線為突變堿基，

反向引物：5’-GGATTGTTGGTGGGATTGCCGTC-3’，下劃線為突變堿基。

PCR反應體系均為：5×PrimeSTAR?Buffer(Mg²⁺Plus)10μL，dNTPs(各2.5mM)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA1μL，PrimeSTAR?HS?DNA?Polymerase(2.5U/μL)0.5μL，加入雙蒸水32.5μL。

PCR反應擴增條件均為：PCR擴增條件均為：98℃預變性4min；隨后98℃10s，55℃15s，72℃8min進行35個循環；最后72℃保溫10min。