[發明專利]增強β-環糊精葡萄糖基轉移酶產β-環糊精能力的突變方法

在審

• 申請號: 201310153385.0
• 申請日: 2013-04-26
• 公開（公告）號: CN103555685A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發明（設計）人: 顧正彪;李兆豐;班宵逢;程力;洪雁;李才明
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/10;C12N15/75;C12R1/09;C12R1/125
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1.來源于環狀芽孢桿菌(Bacillus?circulans)STB01的環糊精葡萄糖基轉移酶，簡稱CGT酶，的三種突變體A31R、A31P和A31T，其特征是：將CGT酶中第31位丙氨酸(Ala)分別用精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)或蘇氨酸(Thr)進行取代，分別命名為A31R、A31P和A31T；相比于野生CGT酶，突變體A31R、A31P和A31T具有更高的產β-環糊精的能力。

2.權利要求書1中三種突變體A31R、A31P和A31T的制備方法，是根據B.circulans?STB01的CGT酶基因序列，分別設計突變引物，對CGT酶基因進行定點突變和測序驗證后，將突變基因轉入枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)WB600中進行表達。

3.權利要求書2所述突變體A31R、A31P和A31T的制備：

(1)定點突變

利用快速PCR技術，以含野生CGT酶基因的表達載體pST/cgt為模板進行定點突變。

引入Arg31密碼子的定點突變引物：

正向引物：5’-GACGGCAATCCCCGCAACAATCC-3’，下劃線為突變堿基，

反向引物：5’-GGATTGTTGCGGGGATTGCCGTC-3’，下劃線為突變堿基；

引入Pro31密碼子的定點突變引物：

正向引物：5’-GACGGCAATCCCCCCAACAATCC-3’，下劃線為突變堿基，

反向引物：5’-GGATTGTTGGGGGGATTGCCGTC-3’，下劃線為突變堿基；

引入Thr31密碼子的定點突變引物：

正向引物：5’-GACGGCAATCCCACCAACAATCC-3’，下劃線為突變堿基，

反向引物：5’-GGATTGTTGGTGGGATTGCCGTC-3’，下劃線為突變堿基。

PCR反應體系均為：5×PrimeSTAR?Buffer(Mg²⁺Plus)10μL，dNTPs(各2.5mM)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA1μL，PrimeSTAR?HS?DNA?Polymerase(2.5U/μL)0.5μL，加入雙蒸水32.5μL。

PCR反應擴增條件均為：PCR擴增條件均為：98℃預變性4min；隨后98℃10s，55℃15s，72℃8min進行35個循環；最后72℃保溫10min。

將PCR產物經過DpnI消化2h后，轉入大腸桿菌(Escherichia?coli)JM109感受態細胞中，涂布到含有瓊脂的LB固體培養基中培養過夜，挑取單菌落于LB液體培養基中培養過夜后提取質粒并進行測序驗證。將突變質粒轉入表達宿主B.subtilis?WB600感受態細胞中。各培養基中均添加5μg/mL硫酸卡那霉素和10μg/mL赤霉素。

(2)突變體的表達

挑取含突變質粒的表達宿主B.subtilis?WB600的單克隆于LB培養基中，在37℃、200r/min下培養8～12h，以4％(v/v)接種量接種到TB培養基中，在37℃、200r/min下發酵48h。將發酵液于4℃、10000rpm離心20min以除去菌體，收集上清液并純化，分別得到突變體A31R、A31P和A31T酶制品。各培養基中添加5μg/mL卡那霉素和10μg/mL赤霉素。