[發明專利]一種具有高穩定性和高特異性的葡萄糖脫氫酶細菌表面展示系統及其制備和應用

在審

• 申請號: 201310152468.8
• 申請日: 2013-04-27
• 公開（公告）號: CN104120102A
• 公開（公告）日: 2014-10-29
• 發明（設計）人: 劉愛驊;梁波;唐湘江
• 申請（專利權）人: 中國科學院青島生物能源與過程研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/63
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體的說是一種具有高穩定性和高特異性的葡萄糖脫氫酶細菌表面展示系統及其制備和應用。?

背景技術

葡萄糖脫氫酶(GDH)(EC1.1.1.47)廣泛參與生物體中的葡萄糖代謝途徑，特別是芽孢桿菌在芽孢形成階段的關鍵酶。借助于輔酶NAD(P)⁺，葡萄糖在GDH的催化下被氧化成葡萄糖酸內酯，輔酶NAD(P)⁺則被還原為NAD(P)H。自二十世紀八十年代起，研究人員就已經克隆了來源于芽孢桿菌的GDH，并在大腸桿菌中進行了高效表達。?

來源于芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶屬于短鏈脫氫酶/還原酶家族(short-chain?dehydrogenase/reductase，SDR)，是由四個相同的亞基組成的四聚體蛋白，單體的分子量約為30kDa。野生型的GDH熱穩定性和pH穩定性都不理想，因此，在實際應用上受到了一定的限制。鑒于此，研究人員開始對編碼GDH的基因進行體外定向進化的研究，Makino和Nagao等人采用化學誘變的方法對來源于Bacillus?megaterium?IWG3的葡萄糖脫氫酶進行了突變，得到了多株熱穩定性提高的突變體，其中E96A的熱穩定性最高，與野生型相比提高了約20℃。Baik等人采用DNA重排技術突變來源于Bacillus?licheniformis?IFO12200，Bacillus?megaterium?IFO15308，Bacillus?subtilis?IFO13719和Bacillus?megaterium?IWG3的一個突變體F20(Q252L)，獲得了一個熱穩定性顯著提高的突變體DN46(E170K/Q252L)，DN46在66℃的半衰期為540分鐘，而F20僅為1.3分鐘。GDH的三維結構研究表明，突變體通過增強疏水作用和減小離子的排斥作用顯著增強了亞基與亞基之間的相互作用力，穩定了酶的三維結構，從而提高了酶的穩定性。在此基礎上，Vazquez-Figueroa等人對來自于Bacillus?subtilis的葡萄糖脫氫酶進行了有理設計，得到了多個突變體，其中K170/L252突變體的Tm值和野生型相比提高了34.7℃。?

在底物特異性方面，GDH對其天然底物β-D-葡萄糖的特異性并不高，對結構類似的木糖、半乳糖、甘露糖都有較弱的催化作用。研究人員在GDH三維結構研究的基礎上，突變了巨大芽孢桿菌IAM1030中IV-GDH的C-末端區域的氨基酸殘基，得到了多個突變體，它們對其底物特異性都有很大的影響。?

綜上所述，研究者廣泛采取隨機突變、DNA重排等基因工程的手段，在一定程度上提高了GDH的穩定性和底物特異性，但是這些方法需要將表達?的突變蛋白進行純化，然后再測定其酶活性，上述過程費時費力，需要昂貴的儀器設備，過程復雜且不易操作，尤其不適用于高通量的突變體篩選。?

微生物表面展示技術是利用基因工程的手段將外源蛋白通過融合適當的錨定蛋白而表達在微生物細胞的表面，例如0mpA、冰核蛋白(ice-nucleation?protein，INP)和凝集素等都可以作為錨定蛋白。這種技術被廣泛用于蛋白質工程，疫苗設計，疾病診治，工業和環保等領域。由于被展示的蛋白在細胞表面具有相對獨立的空間結構和生物學活性，能夠直接與底物進行充分的反應，而且表面展示文庫具有高通量、高靈敏度的特點，因此微生物表面展示技術在研究蛋白質生物學功能方面具有很大的應用前景。Tan等利用OprI作為錨定蛋白將聚(R)的3-羥基丁酸酯(PHB)解聚酶突變體展示在大腸桿菌的表面，篩選得到酶活性提高的突變體，研究了參與底物識別的關鍵氨基酸殘基。由此可見，微生物表面展示技術是用來研究蛋白功能和特性的一個非常簡單、有效的手段。INP是丁香假單胞菌等菌株的外膜蛋白，可催化過冷卻水結冰。外源蛋白可與INP融合，通過糖基磷脂酰肌醇而錨定在細菌表面。全長的冰核蛋白包括N端、C端和中間重復序列。與其他錨定蛋白相比，外源蛋白可以在宿主細胞中穩定的表達，而且能夠高效的展示在細菌表面。?

Quikchange定點突變技術是通過設計含有突變位點的引物，利用PCR反應，以質粒為模板，在高保真DNA聚合酶的作用下進行延伸，得到含有突變位點的DNA雙鏈質粒，這種質粒是未甲基化的，而大腸桿菌自身的質粒DNA是甲基化的，這樣就可以通過DpnI酶消化去除原始模板，最后得到突變的質粒，經過轉化得到突變的菌株。該技術操作簡便，效率高，現已成功用于各種突變體的構建。?

發明內容