[發明專利]基于桔小實蠅氣味結合蛋白的引誘劑篩選方法

無效

• 申請號: 201310152315.3
• 申請日: 2013-04-27
• 公開（公告）號: CN103245647A
• 公開（公告）日: 2013-08-14
• 發明（設計）人: 李紅亮;陳玲;商晗武;王強
• 申請（專利權）人: 中國計量學院
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;C12N15/12;C12N15/70;C07K14/435;C07K1/22
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙) 33213
• 代理人: 吳秉中

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及基于桔小實蠅氣味結合蛋白的引誘劑篩選方法。

背景技術

桔小實蠅Bactrocera?dorsalis，又名東方果實蠅（Orient?fruit?fly），屬雙翅目（Diptera），實蠅科（Tephritidae），果實蠅屬Bactrocera?Macquart，是一類重要的檢疫性害蟲。該蟲寄主范圍廣，據報道可以為害46科250多種水果，對香蕉、番石榴、芒果和柑橘等為害嚴重，給我國水果產業造成巨大的經濟損失。目前生產上主要采取化學防治控制其危害，但化學農藥不僅易造成水果和環境污染，且因其為害方式特殊（主要以成蟲產卵于果實果皮下，幼蟲潛居果瓤取食，有果皮的物理屏蔽）而難以奏效。由于植食性昆蟲對其嗜好的寄主植物氣味有明顯的選擇傾向，而桔小實蠅對于多種寄主水果也具有較明顯的嗜好性，如番石榴、葡萄、甜橙、香蕉等水果均是桔小實蠅的重要水果寄主，而桔小實蠅也都能夠對它們產生顯著的嗅覺引誘反應，因此我們可以根據桔小實蠅的主要寄主水果揮發物篩選和獲得其嗅覺引誘劑。但由于各種水果的揮發物成分種類復雜，如何篩選出合適的引誘劑配方成為制約桔小實蠅嗅覺引誘劑尤其是雌蟲引誘劑的瓶頸。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明的目的在于設計提供基于桔小實蠅氣味結合蛋白的引誘劑篩選方法的技術方案。

所述的基于桔小實蠅氣味結合蛋白的引誘劑篩選方法，其特征在于包括以下工藝步驟：

1）收集桔小實蠅觸角總RNA；

2）通過RT-PCR獲得桔小實蠅氣味結合蛋白的全長；

3）構建桔小實蠅氣味結合蛋白的原核表達載體；

4）通過IPTG誘導桔小實蠅重組氣味結合蛋白表達，并通過鎳瓊脂糖凝膠親和層析柱對其進行純化；

5）通過競爭性熒光結合方法獲得桔小實蠅重組氣味結合蛋白與寄主水果氣味揮發物的結合反應譜，解離常數K_D低于10μmol/L寄主水果嗅覺以下，熒光競爭的IC₅₀值小于30μmol/L時，確定為適合桔小實蠅的寄主水果嗅覺引誘劑。

所述的基于桔小實蠅氣味結合蛋白的引誘劑篩選方法，其特征在于所述的步驟4）中IPTG誘導桔小實蠅重組氣味結合蛋白表達的誘導條件為：IPTG濃度為0.8～1.2mmol/L，溫度為28～32℃，誘導轉速為150～250rpm，誘導時間為4～6h。

所述的基于桔小實蠅氣味結合蛋白的引誘劑篩選方法，其特征在于所述的步驟4）中IPTG誘導桔小實蠅重組氣味結合蛋白表達的誘導條件為：IPTG濃度為1.0mmol/L，溫度為30℃，誘導轉速為200rpm，誘導時間為5h。

所述的基于桔小實蠅氣味結合蛋白的引誘劑篩選方法，其特征在于所述的步驟5）中競爭性熒光結合方法獲得桔小實蠅重組氣味結合蛋白與寄主水果氣味揮發物的結合反應譜的工藝步驟包括：

1）熒光配基1-NPN與桔小實蠅重組氣味結合蛋白的結合

在282nm激發波長下，向1μmol/L的桔小實蠅重組氣味結合蛋白中逐次加入1mmol/L的1-NPN，充分混勻；

2）配基結合和EAG驗證

選取桔小實蠅寄主水果主要氣味揮發物和1-NPN進行競爭結合桔小實蠅重組氣味結合蛋白，如果桔小實蠅寄主水果主要氣味揮發物、1-NPN與BdorOBP相對熒光值競爭至50%?以下，并且解離常數K_D低于10μmol/L寄主水果嗅覺以下，熒光競爭的IC₅₀值小于30?μmol/L時或者熒光值競爭至30%以下時，則確定為適合桔小實蠅的寄主水果嗅覺引誘劑。

本發明從桔小實蠅嗅覺生理的模式出發，通過分子生物學技術克隆了其氣味結合蛋白全長基因，并通過原核表達技術獲得了編碼該基因的重組蛋白，最后通過生物化學結合技術探討了其與不同茶樹來源的寄主水果嗅覺揮發物的親和力。本發明為桔小實蠅寄主水果嗅覺氣味信息引誘劑配方的篩選和設計提供了新的策略。

附圖說明

圖1為BdorOBP2基因的PCR擴增圖；

圖2?為菌落PCR鑒定圖；

圖3為重組桔小實蠅氣味蛋白BdorOBP的分離純化圖；

圖4為重組BdorOBP蛋白與熒光配基1-NPN的熒光結合曲線圖；

圖5為候選配基與熒光配基1-NPN和重組BdorOBP蛋白的競爭結合圖；