[發(fā)明專利]基于桔小實(shí)蠅氣味結(jié)合蛋白的引誘劑篩選方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310152315.3
• 申請(qǐng)日: 2013-04-27
• 公開（公告）號(hào): CN103245647A
• 公開（公告）日: 2013-08-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李紅亮;陳玲;商晗武;王強(qiáng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)計(jì)量學(xué)院
• 主分類號(hào): G01N21/64
• 分類號(hào): G01N21/64;C12N15/12;C12N15/70;C07K14/435;C07K1/22
• 代理公司: 杭州浙科專利事務(wù)所(普通合伙) 33213
• 代理人: 吳秉中

1.基于桔小實(shí)蠅氣味結(jié)合蛋白的引誘劑篩選方法，其特征在于包括以下工藝步驟：

1）收集桔小實(shí)蠅觸角總RNA；

2）通過RT-PCR獲得桔小實(shí)蠅氣味結(jié)合蛋白的全長(zhǎng)；

3）構(gòu)建桔小實(shí)蠅氣味結(jié)合蛋白的原核表達(dá)載體；

4）通過IPTG誘導(dǎo)桔小實(shí)蠅重組氣味結(jié)合蛋白表達(dá)，并通過鎳瓊脂糖凝膠親和層析柱對(duì)其進(jìn)行純化；

5）通過競(jìng)爭(zhēng)性熒光結(jié)合方法獲得桔小實(shí)蠅重組氣味結(jié)合蛋白與寄主水果氣味揮發(fā)物的結(jié)合反應(yīng)譜，解離常數(shù)KD低于10μmol/L寄主水果嗅覺以下，熒光競(jìng)爭(zhēng)的IC50值小于30μmol/L時(shí)，確定為適合桔小實(shí)蠅的寄主水果嗅覺引誘劑。

2.如權(quán)利要求1所述的基于桔小實(shí)蠅氣味結(jié)合蛋白的引誘劑篩選方法，其特征在于所述的步驟4）中IPTG誘導(dǎo)桔小實(shí)蠅重組氣味結(jié)合蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)條件為：IPTG濃度為0.8～1.2mmol/L，溫度為28～32℃，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)速為150～250rpm，誘導(dǎo)時(shí)間為4～6h。

3.如權(quán)利要求1所述的基于桔小實(shí)蠅氣味結(jié)合蛋白的引誘劑篩選方法，其特征在于所述的步驟4）中IPTG誘導(dǎo)桔小實(shí)蠅重組氣味結(jié)合蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)條件為：IPTG濃度為1.0mmol/L，溫度為30℃，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)速為200rpm，誘導(dǎo)時(shí)間為5h。

4.如權(quán)利要求1所述的基于桔小實(shí)蠅氣味結(jié)合蛋白的引誘劑篩選方法，其特征在于所述的步驟5）中競(jìng)爭(zhēng)性熒光結(jié)合方法獲得桔小實(shí)蠅重組氣味結(jié)合蛋白與寄主水果氣味揮發(fā)物的結(jié)合反應(yīng)譜的工藝步驟包括：

1）熒光配基1-NPN與桔小實(shí)蠅重組氣味結(jié)合蛋白的結(jié)合

在282nm激發(fā)波長(zhǎng)下，向1μmol/L的桔小實(shí)蠅重組氣味結(jié)合蛋白中逐次加入1mmol/L的1-NPN，充分混勻；

2）配基結(jié)合和EAG驗(yàn)證

選取桔小實(shí)蠅寄主水果主要?dú)馕稉]發(fā)物和1-NPN進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合桔小實(shí)蠅重組氣味結(jié)合蛋白，如果桔小實(shí)蠅寄主水果主要?dú)馕稉]發(fā)物、1-NPN與BdorOBP相對(duì)熒光值競(jìng)爭(zhēng)至50%?以下，并且解離常數(shù)KD低于10μmol/L寄主水果嗅覺以下，熒光競(jìng)爭(zhēng)的IC50值小于30μmol/L時(shí)或者熒光值競(jìng)爭(zhēng)至30%以下時(shí)，則確定為適合桔小實(shí)蠅的寄主水果寄主水果嗅覺嗅覺引誘劑。