[發明專利]基于桔小實蠅氣味結合蛋白的引誘劑篩選方法

無效

• 申請號: 201310152315.3
• 申請日: 2013-04-27
• 公開（公告）號: CN103245647A
• 公開（公告）日: 2013-08-14
• 發明（設計）人: 李紅亮;陳玲;商晗武;王強
• 申請（專利權）人: 中國計量學院
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;C12N15/12;C12N15/70;C07K14/435;C07K1/22
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙) 33213
• 代理人: 吳秉中

1.基于桔小實蠅氣味結合蛋白的引誘劑篩選方法，其特征在于包括以下工藝步驟：

1）收集桔小實蠅觸角總RNA；

2）通過RT-PCR獲得桔小實蠅氣味結合蛋白的全長；

3）構建桔小實蠅氣味結合蛋白的原核表達載體；

4）通過IPTG誘導桔小實蠅重組氣味結合蛋白表達，并通過鎳瓊脂糖凝膠親和層析柱對其進行純化；

5）通過競爭性熒光結合方法獲得桔小實蠅重組氣味結合蛋白與寄主水果氣味揮發物的結合反應譜，解離常數KD低于10μmol/L寄主水果嗅覺以下，熒光競爭的IC50值小于30μmol/L時，確定為適合桔小實蠅的寄主水果嗅覺引誘劑。

2.如權利要求1所述的基于桔小實蠅氣味結合蛋白的引誘劑篩選方法，其特征在于所述的步驟4）中IPTG誘導桔小實蠅重組氣味結合蛋白表達的誘導條件為：IPTG濃度為0.8～1.2mmol/L，溫度為28～32℃，誘導轉速為150～250rpm，誘導時間為4～6h。

3.如權利要求1所述的基于桔小實蠅氣味結合蛋白的引誘劑篩選方法，其特征在于所述的步驟4）中IPTG誘導桔小實蠅重組氣味結合蛋白表達的誘導條件為：IPTG濃度為1.0mmol/L，溫度為30℃，誘導轉速為200rpm，誘導時間為5h。

4.如權利要求1所述的基于桔小實蠅氣味結合蛋白的引誘劑篩選方法，其特征在于所述的步驟5）中競爭性熒光結合方法獲得桔小實蠅重組氣味結合蛋白與寄主水果氣味揮發物的結合反應譜的工藝步驟包括：

1）熒光配基1-NPN與桔小實蠅重組氣味結合蛋白的結合

在282nm激發波長下，向1μmol/L的桔小實蠅重組氣味結合蛋白中逐次加入1mmol/L的1-NPN，充分混勻；

2）配基結合和EAG驗證

選取桔小實蠅寄主水果主要氣味揮發物和1-NPN進行競爭結合桔小實蠅重組氣味結合蛋白，如果桔小實蠅寄主水果主要氣味揮發物、1-NPN與BdorOBP相對熒光值競爭至50%?以下，并且解離常數KD低于10μmol/L寄主水果嗅覺以下，熒光競爭的IC50值小于30μmol/L時或者熒光值競爭至30%以下時，則確定為適合桔小實蠅的寄主水果寄主水果嗅覺嗅覺引誘劑。