[發明專利]含有富含亮氨酸重復序列的融合蛋白及其制法和應用

在審

• 申請號: 201310151609.4
• 申請日: 2013-04-26
• 公開（公告）號: CN104119448A
• 公開（公告）日: 2014-10-29
• 發明（設計）人: 李華順
• 申請（專利權）人: 李華順
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/63;C12N5/10;C12P21/02
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 祝蓮君;雷芳

技術領域

本發明涉及生物分子領域，尤其涉及含有富含亮氨酸重復序列的融合蛋白及其制法和應用。

背景技術

神經導向因子Slit是一種在進化上高度保守的分泌型細胞外基質糖蛋白，其基因在1988年發現在中樞神經系統的形成中發揮作用。Slit是一組相對分子質量為170-190kDa的細胞外分泌蛋白，對軸突生長和神經元遷移起導向作用的軸突定向分子族成員之一。

Slit蛋白是作為Roundabout(Robo)的配體發揮多功能的導向分子，它不僅具有調節神經軸突生長方向、引導神經細胞遷移、影響神經細胞形態分化的功能。近年來的研究發現，Slit在血管生成、心臟形態發生、腫瘤細胞遷移等多種生理過程中也發揮作用。

在脊椎動物中存在3種Slit基因，即Slitl、Slit2、Slit3，并在各種生物組織中廣泛表達。

Slit蛋白的主要結構包括N端的胞外分泌信號肽,4個連續的富含亮氨酸的重復序列(leucine-rich?repeat，LRRs),也被命名為D1-D4結構域，串聯的6-9個EGF(epidermal?growth?factor)樣功能區，一個laminin?G樣結構域和一個富含半光氨酸的C末端結構域。

為了研究和應用，有必要對Slit蛋白或其片段進行表達和分離純化。然而，由于天然蛋白的含量有限，分離困難，因此需要開發高效的重組生產工藝。

在重組生產工藝中，高效地生產出構象正確且便于分離和純化的目的蛋白，常常是較為困難的。常用的大腸桿菌表達系統雖然可以較高效地表達目的蛋白，但卻常常需要復雜的復性工藝，且復性后的目標蛋白的活性往往難以令人滿意。

當采用真核表達系統進行表達時，雖然避免了復性工藝，但目標蛋白的正確折疊、如何實現高表達水平以及如何有效分離目標蛋白仍然是難點，尤其是對于某些短肽或含重復序列的多肽而言。

獲得了含目標蛋白的培養液(或發酵產物)后，可采用各種不同的純化手段進行分離純化。目前，一種常用的分離純化重組蛋白的方法為親和層析技術。

以采用的His標簽為例，6×His是專門設計用于重組蛋白質純化工作的標簽蛋白，是目前最常見的表達方式，其表達純化技術都很成熟，而且相對比便宜，它的優點是表達方便而且基本不影響蛋白的活性。通常帶組氨酸蛋白都可以在天然情況下被鎳瓊脂糖凝膠或鎳NTA瓊脂糖凝膠吸附，但是因為His標簽非常小，如果在融合蛋白折疊過程中被折疊到蛋白內部而導致His標簽不容易暴露的話，則很難開展蛋白純化工作；同時His標簽確實還存在特異性不夠的問題。

通常，使用His標簽技術分離所得的蛋白質純度約為90%左右，而現有技術中，使蛋白進一步純化的工藝和步驟都相對較為繁瑣，且添加的蛋白或肽段常會對目標蛋白的活性造成干擾，導致目標蛋白的表達不準確或雜質過多。

綜上所述，為了簡便高效地制備高純度、高活性的重組蛋白，本領域迫切需要開發高效簡便的生產工藝。

發明內容

本發明的目的就是提供一種高效簡便的生產外源蛋白的方法，從而簡便高效地制備高純度、高活性的重組蛋白。

本發明提供了一種融合蛋白，所述的融合蛋白自N端至C端具有式Ia或Ib所述的結構：

A—X—E—Y1—Y2???式Ia；

A—Y2—Y1—E—X???式Ib；

其中，

A為任選的分泌信號肽；

X為Slit3蛋白的富含亮氨酸的重復序列2(leucine-rich?repeat2，LRR2)元件；

E為酶切位點；

Y1為第一標簽多肽元件；

Y2為第二標簽短肽元件，所述第二標簽短肽元件為His標簽元件；

“—”表示連接上述元件的肽鍵或肽接頭。

在另一優選例中，所述的融合蛋白具有位于N端的分泌信號肽。

在另一優選例中，所述的分泌信號肽是來自于Slit3的分泌信號肽、或來自于其他蛋白的分泌信號肽。

在另一優選例中，所述的分泌信號肽在其N端具有或不具有起始氨基酸Met。

在另一優選例中，所述的第一標簽多肽元件的46aa。

在另一優選例中，在X和E之間的“—”為肽鍵。

在另一優選例中，在Y1和Y2之間無蛋白酶切位點。

在另一優選例中，在Y1和Y2之間的“—”為肽鍵。

在另一優選例中，所述的酶切位點是TEV蛋白酶的酶切位點。