[發(fā)明專利]熒光檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310151570.6
• 申請日: 2013-04-27
• 公開（公告）號: CN103472040A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄧秉華;林清格;陳宏銘
• 申請（專利權(quán)）人: 瑞基海洋生物科技股份有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 北京律誠同業(yè)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11006
• 代理人: 徐金國

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明與包含酶或微生物的測定或檢驗(yàn)方法有關(guān)，特別是有關(guān)于一種熒光檢測方法。

背景技術(shù)

利用熒光，是檢測核酸的一種技術(shù)。是利用適當(dāng)波長的光照射具有熒光性質(zhì)的樣品，樣品會吸收光的能量而被激發(fā)至高能量狀態(tài)，并在極短時(shí)間內(nèi)回復(fù)低能量狀態(tài)，同時(shí)以放光的形式將多余能量釋出。當(dāng)樣品上結(jié)合有熒光或可呈色的化學(xué)物質(zhì)，便能提供光源，使化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)生熒光反應(yīng)。借此，由外部觀察是否有熒光反應(yīng)，便能知道樣品有沒有結(jié)合化學(xué)物質(zhì)，或者是結(jié)合化學(xué)物質(zhì)的樣品是否存在。

已知的熒光技術(shù)系統(tǒng)通常包含一激發(fā)光源、一感光元件、一聚光裝置。當(dāng)光源照射在樣品上，樣品吸收能量產(chǎn)生光致熒光效應(yīng)后發(fā)出熒光，但因?yàn)闊晒庑盘栁⑷跚乙嗍芷渌庠锤蓴_如激發(fā)光源，需通過聚光裝置收集后才能由感光元件感測。上述的聚光裝置通常由多片透鏡、反射鏡及放射光濾片(Emission?Filter)組成，其光路復(fù)雜且不容易精確。而且光源通常為汞燈、氙燈或鹵素?zé)舻龋m其發(fā)光波長涵蓋范圍長，但激發(fā)光源需針對不同的熒光指示劑下去做選擇波段，所以還必須使用不同濾鏡做搭配，耗費(fèi)成本高且激發(fā)能量弱。而感光元件感測光信號后將其轉(zhuǎn)為電流信號，又需通過轉(zhuǎn)阻放大器(Trans-impedance?Amplifier,TIA)將此電流信號轉(zhuǎn)換為模擬電壓信號，再利用模擬數(shù)字轉(zhuǎn)換電路(Analog?to?Digital?Converter,ADC)將模擬電壓信號轉(zhuǎn)為數(shù)字電壓信號，才能得出所需的實(shí)驗(yàn)要據(jù)，如此一來手續(xù)繁雜又需增加額外成本支出。

一般由外部判斷熒光反應(yīng)的技術(shù)，是直接接收熒光，當(dāng)熒光強(qiáng)度高于特定值，便視為有熒光反應(yīng)。然而接收熒光的技術(shù)，容易受環(huán)境影響，難有穩(wěn)定的準(zhǔn)確度。且已知的熒光檢測技術(shù)裝置大體上為體積龐大的復(fù)雜系統(tǒng)，攜帶不便，如有須檢測的樣品需帶回實(shí)驗(yàn)室才有辦法進(jìn)行檢測，浪費(fèi)時(shí)間且麻煩。

有鑒于上述問題，本發(fā)明提供了一種方便且檢測準(zhǔn)確度更為穩(wěn)定的一種熒光檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容

因此本發(fā)明的一目的在于提供一種熒光檢測方法，利用灰階影像與比對技術(shù)準(zhǔn)確快速地分辨出樣品是否有熒光信號。

將熒光檢測試劑加入樣品中；將樣品盛裝至一樣品盤中。其中該樣品盤包含至少一列背景樣品孔。以及至少一列待測樣品孔。以一背景光源照射該樣品盤。取得該樣品盤的一背景灰階影像。

根據(jù)本發(fā)明一實(shí)施方式，上述熒光檢測方法還包含下述步驟。均值濾波背景灰階影像。二值化背景灰階影像。根據(jù)二值化后的背景灰階影像，計(jì)算出背景樣品孔的邊緣位置。根據(jù)背景樣品孔的邊緣位置，計(jì)算出待測樣品孔的邊緣位置。取得位于背景樣品孔內(nèi)的灰階像素?cái)?shù)據(jù)，并將其平均，作為一背景信號臨界值。根據(jù)待測樣品孔的邊緣位置以及背景信號臨界值，對待測樣品孔進(jìn)行熒光信號讀取作業(yè)。

依據(jù)本發(fā)明又一實(shí)施方式，上述對待測樣品孔進(jìn)行熒光信號讀取作業(yè)的步驟，包含以背景光源照射樣品盤；取得樣品盤的一待測灰階影像。均值濾波待測灰階影像，取得位于待測樣品孔內(nèi)的灰階像素?cái)?shù)據(jù)。逐個(gè)判斷位于待測樣品孔內(nèi)的灰階像素?cái)?shù)據(jù)是否大于背景信號臨界值；以及當(dāng)位于待測樣品孔內(nèi)的灰階像素?cái)?shù)據(jù)大于背景信號臨界值時(shí)，判斷為讀出熒光信號。

依據(jù)本發(fā)明另一實(shí)施方式，上述對待測樣品孔進(jìn)行熒光信號讀取作業(yè)的步驟，還包含根據(jù)待測灰階影像，取得位于背景樣品孔內(nèi)的灰階像素?cái)?shù)據(jù)；根據(jù)位于背景樣品孔內(nèi)的灰階像素?cái)?shù)據(jù)，判斷是否讀出光源信號，當(dāng)未讀出光源信號時(shí)，判斷為異常狀況，并終止實(shí)驗(yàn)。

依據(jù)本發(fā)明再一實(shí)施方式，其中對于取得樣品盤的背景灰階影像的步驟是以電荷耦合元件(Charge-couple?Device,CCD)或互補(bǔ)式金屬氧化物半導(dǎo)體(Complementary?Metal?Oxide?Semiconductor,CMOS)等光感測器為之。

依據(jù)本發(fā)明又一實(shí)施方式，其中背景樣品孔上覆蓋有一減光片或偏光片，且待測樣品孔上覆蓋有一熒光濾鏡。而背景光源為一發(fā)光二極管或一激光光源，且背景光源照射樣品盤的方向，是選自樣品盤的上方、側(cè)邊、下方、及其組合。