[發(fā)明專利]一種SBR中活性污泥樣品DNA的提取方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310151351.8
• 申請日: 2013-04-26
• 公開（公告）號: CN103215254A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙曉祥;張灣;鄧航
• 申請（專利權(quán)）人: 東華大學(xué)
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 上海泰能知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 31233
• 代理人: 黃志達(dá)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于DNA的提取領(lǐng)域，特別涉及一種SBR中活性污泥樣品DNA的提取方法。

背景技術(shù)

活性污泥中細(xì)菌總DNA提取的不同方法得到的DNA純度不同，分析DNA的純度，用于了解微生物的群落結(jié)構(gòu)，對鑒定和分離處理系統(tǒng)中的優(yōu)勢菌很重要。力求通過這多方面的研究來提高生物處理染料廢水處理能力。DNA提取是分子學(xué)技術(shù)的前提條件。只有提取出了足夠的并且純度適宜的DNA,才能進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)和研究，所以DNA的提取可以說是分子生物學(xué)的關(guān)鍵所在。

關(guān)于活性污泥中細(xì)菌總DNA提取方法：提取活性污泥DNA時(shí)，對樣品進(jìn)行預(yù)處理是非常必需的。活性污泥中含有大量的腐殖酸、褐菌素和重金屬離子等雜質(zhì)，還有一些胞外游離的DNA，它們都極大地影響DNA提取以及后續(xù)工作，采用TENP和PBS緩沖液對污泥樣品進(jìn)行預(yù)處理，可以去除污泥樣品中的腐殖酸、各種離子、無機(jī)物及有機(jī)物等雜質(zhì)，減少胞外游離DNA的污染。

細(xì)胞裂解是破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的過程。常用的裂解方法有化學(xué)、酶和機(jī)械裂解。本實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)裂解法直接從廢水樣品中提取基因組DNA。蛋白的去除使用的是傳統(tǒng)的苯酚氯仿抽提法。核酸的沉淀一般選擇在乙醇、異丙醇等溶劑中進(jìn)行，使用異丙醇可以得到較高產(chǎn)量的DNA并且腐殖酸的含量較低，故本實(shí)驗(yàn)中選用異丙醇來沉淀DNA。沉淀得到的DNA通常會含有腐殖酸和酚類化合物等雜質(zhì)，這些雜質(zhì)會影響到后續(xù)的分析，特別是PCR擴(kuò)增。低量的腐殖酸會抑制PCR反應(yīng)，使其得不到任何產(chǎn)物。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種SBR中活性污泥樣品DNA的提取方法，該方法具有快速，高效的特點(diǎn)，可以高效提取印染廢水或相同的水質(zhì)情況廢水的活性污泥基因組DNA，具有良好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明的一種SBR中活性污泥樣品DNA的提取方法，包括：

（1）活性污泥樣樣品在處理前首先混勻，使其中的懸浮物質(zhì)分布均勻；采用TENP、PBS溶液和玻璃珠震蕩法對樣品進(jìn)行預(yù)處理；將經(jīng)預(yù)處理的污泥樣品采用凍融法破碎，冷藏、沸水煮，再加入質(zhì)量百分比濃度2%～10%的SDS緩沖液去除蛋白質(zhì)；

（2）加入0.6倍樣品體積的異丙醇，顛倒混勻，進(jìn)行沉淀；離心，倒掉上清液；自然風(fēng)干，用TE緩沖液懸浮樣品，溶解沉淀，即得基因組DNA粗提液；加入RNase?A，35～40℃溫浴15-20min消化RNA，然后采用DNA膠回收試劑盒，按照操作說明進(jìn)行純化；

（3）用紫外分光光度計(jì)測定上述純化DNA樣品在波長230、260、280nm處的吸光光度值；將上述純化DNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后，用紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照。

所述步驟（1）中的TENP溶液體積和PBS溶液體積為污水樣品的3～5倍；玻璃珠直徑為1～2mm，3000～5000rpm離心10～30min。

所述步驟（1）中的冷藏、沸水煮具體為：置于-25～-15℃冰箱中冷藏1～2h，沸水煮10～20min，重復(fù)一次。

所述步驟（1）中冷藏、沸水煮后，加入2～4ml?Extraction?buffer，1～5粒玻璃珠，漩渦5～10min。

所述步驟（1）中的SDS緩沖液的質(zhì)量百分比濃度為2%。

所述步驟（2）中的沉淀具體為放入冰箱內(nèi)沉淀1～2h或過夜沉淀。

所述步驟（2）中的TE緩沖液的用量為100μL。

所述步驟（2）中的RNase?A的濃度為10mg/mL，用量為4μL。

所述步驟（3）中的瓊脂糖凝膠質(zhì)量百分比濃度為1%，電壓為100～110V，電泳0.5～1h。

采用加2%SDS緩沖液和加10%SDS緩沖液作對比，并根據(jù)上面結(jié)果結(jié)合凍融法對經(jīng)預(yù)處理方法處理后的樣品進(jìn)行分析比較，加2%SDS的提取效果要好于10%SDS。

本發(fā)明以印染廢水SBR系統(tǒng)為研究對象，對從反應(yīng)器內(nèi)提取的活性污泥樣品經(jīng)過或未經(jīng)預(yù)處理兩種情況下的污泥樣品，采用玻璃珠震蕩法和凍融法兩種細(xì)胞裂解方法，比較各自DNA提取效果的影響，以期建立一種快速、高效且適用于分子生物學(xué)后續(xù)分析的活性污泥基因組DNA提取新方法。通過吸光度和瓊脂糖凝膠電泳檢測的結(jié)果表明：活性污泥經(jīng)TENP和PBS預(yù)處理后采用凍融法加2%SDS裂解細(xì)胞的DNA提取操作，可以得到數(shù)量多、純度高的活性污泥DNA樣品。

有益效果

本發(fā)明具有快速，高效的特點(diǎn)，可以高效提取印染廢水或相同的水質(zhì)情況廢水的活性污泥基因組DNA，具有良好的應(yīng)用前景。