[發(fā)明專利]一種乳酸菌IIa類抗菌肽的PCR篩選方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310150907.1
• 申請日: 2013-04-26
• 公開（公告）號: CN103276058A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 崔艷華;曲曉軍;陳章庭;張超;王超;丁忠慶
• 申請（專利權(quán)）人: 哈爾濱工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12R1/01
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標(biāo)事務(wù)所 23109
• 代理人: 高會會

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種抗菌肽的篩選方法。

背景技術(shù)

乳酸菌是一群微好氧、G+C含量比較低、能夠發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽性菌。乳酸菌以同型發(fā)酵或者異型發(fā)酵的方式，產(chǎn)生乳酸及乙醇、二氧化碳等一些副產(chǎn)物。乳酸菌廣泛地分布于自然界，與人類關(guān)系密切。乳酸菌能夠加速食品的酸化，并且產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)，增加食物的營養(yǎng)以及改善食品的質(zhì)地。因此乳酸菌在全世界食品生產(chǎn)中，扮演著極其重要的角色。同時一些乳酸菌是重要的益生菌，對于維持人體胃腸道微生態(tài)平衡，抑制腸道內(nèi)病原菌生長，提高機(jī)體免疫力有積極功效。有些乳酸菌可以分泌抗菌肽。

天然抗菌肽及其抗菌機(jī)理是近年研究的熱點，也是未來發(fā)展的必然趨勢。乳酸菌在該領(lǐng)域發(fā)揮了巨大作用。乳酸菌抗菌肽，是乳酸菌在代謝過程中由核糖體產(chǎn)生的具有抗菌活性的多肽或蛋白質(zhì)，以其安全、高效而備受關(guān)注。但現(xiàn)有絕大多數(shù)抗菌肽僅僅能抑制某些親緣關(guān)系較近的革蘭氏陽性菌生長，而對革蘭氏陰性菌和真核微生物(如酵母或霉菌)無抑制作用，因此篩選新型、廣譜、天然、安全的抗菌肽勢在必行。

天然發(fā)酵乳制品、發(fā)酵肉制品、發(fā)酵蔬菜及農(nóng)家自制發(fā)酵制品等特殊的微生態(tài)環(huán)境是篩選新型廣譜乳酸菌抗菌肽的良好環(huán)境，當(dāng)前國內(nèi)外研究者發(fā)現(xiàn)了大量的乳酸菌抗菌肽。大多數(shù)研究選用了直接法進(jìn)行篩選，主要是基于抗菌肽的擴(kuò)散原理，根據(jù)在半固體培養(yǎng)基或者液體培養(yǎng)基上抑制敏感指示菌的生長的情況，判定抗菌肽的產(chǎn)生。基于抗菌肽擴(kuò)散原理，已經(jīng)研發(fā)了瓊脂擴(kuò)散法和濁度法。基于傳統(tǒng)方法篩選獲得產(chǎn)抗菌肽的菌株發(fā)酵后，收集發(fā)酵液，進(jìn)行抗菌肽的分離純化，之后進(jìn)行對其進(jìn)行質(zhì)譜分析，獲得抗菌肽的氨基酸序列信息，進(jìn)而繼續(xù)深入研究，獲得抗菌肽的合成以及調(diào)控基因的相關(guān)信息。以上是傳統(tǒng)的經(jīng)典的抗菌肽篩選和研究的策略。傳統(tǒng)的抗菌肽篩選方法存在敏感性低、耗時長、工作強(qiáng)度大的缺點。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明是要解決傳統(tǒng)的抗菌肽篩選方法存在的敏感性低的技術(shù)問題，從而提供了一種乳酸菌IIa類抗菌肽的PCR篩選方法。

本發(fā)明的一種乳酸菌IIa類抗菌肽的PCR篩選方法按以下步驟進(jìn)行：

一、根據(jù)Enterococcus?faecium中編碼抗菌肽enterocin?A的entA基因33-51位點和123-142位點的序列設(shè)計一對種屬特異性引物Group-5F和Group-5R，然后對乳酸菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

二、PCR產(chǎn)物采用凝膠回收試劑盒回收，將膠回收后的目的DNA，按照零背景快速連接試劑盒說明書操作，連接至載體pZeroblunt上，經(jīng)菌體PCR鑒定確認(rèn)是重組pZeroblunt質(zhì)粒的陽性克隆菌時，在Ep管中加入200～300μL的重組pZeroblunt質(zhì)粒的陽性克隆菌菌液，做好標(biāo)記及密封，送到上海英俊生物有限公司，正反兩個方向同時測序，然后將所得測序結(jié)果進(jìn)行拼接，之后在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，若PCR片段與Enterococcus?faeciumE5、E9等菌株中編碼抗菌肽enterocin?A的基因同源性達(dá)到99％，則為乳酸菌IIa類抗菌肽；

其中，步驟一中Group-5F的核苷酸序列為：5′-GACACAACTTATCTATGGGG-3′；Group-5R的核苷酸序列為：5′-TACAAGTAGTTGCCTTGGCC-3′。

本發(fā)明包括以下有益效果：

本發(fā)明根據(jù)不同種屬乳酸菌的抗菌肽的自身特點，設(shè)計相應(yīng)種屬特異性引物，用于篩選抗菌肽產(chǎn)生菌，然后對乳酸菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)優(yōu)化PCR條件后，篩選到具有目標(biāo)條帶的菌株即疑似的產(chǎn)IIa抗菌肽的乳酸菌。為驗證其序列的可靠性，故將陽性PCR產(chǎn)物連接到pZeroblunt載體中再進(jìn)行測序比對，最后發(fā)現(xiàn)其基因序列與enterocin?A的編碼基因的同源性為99％，說明該菌攜帶enterocinA，體現(xiàn)本發(fā)明的抗菌肽篩選方法的敏感性高。

附圖說明

圖1為試驗一步驟二的測序結(jié)果比對圖；

圖2為試驗二菌株M26和M151對李斯特菌的抑制情況圖。

具體實施方式

具體實施方式一：本實施方式一種乳酸菌IIa類抗菌肽的PCR篩選方法是按以下步驟進(jìn)行的：

一、根據(jù)Enterococcus?faecium中編碼抗菌肽enterocin?A的entA基因33-51位點和123-142位點的序列設(shè)計一對種屬特異性引物Group-5F和Group-5R，然后對乳酸菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；