[發明專利]一種乳酸菌IIa類抗菌肽的PCR篩選方法

無效

• 申請號: 201310150907.1
• 申請日: 2013-04-26
• 公開（公告）號: CN103276058A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發明（設計）人: 崔艷華;曲曉軍;陳章庭;張超;王超;丁忠慶
• 申請（專利權）人: 哈爾濱工業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12R1/01
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 高會會

1.一種乳酸菌IIa類抗菌肽的PCR篩選方法，其特征在于乳酸菌IIa類抗菌肽的PCR篩選方法是按以下步驟進行的：

一、根據Enterococcus?faecium中編碼抗菌肽enterocin?A的entA基因33-51位點和123-142位點的序列設計一對種屬特異性引物Group-5F和Group-5R，然后對乳酸菌基因組DNA進行PCR擴增，得到PCR擴增產物；

二、PCR產物采用凝膠回收試劑盒回收，將膠回收后的目的DNA，按照零背景快速連接試劑盒說明書操作，連接至載體pZeroblunt上，經菌體PCR鑒定確認是重組pZeroblunt質粒的陽性克隆菌時，在Ep管中加入200～300μL的重組pZeroblunt質粒的陽性克隆菌菌液，做好標記及密封，送到上海英俊生物有限公司，正反兩個方向同時測序，然后將所得測序結果進行拼接，之后在NCBI數據庫中進行比對，若PCR片段與Enterococcus?faecium?E5、E9等菌株中編碼抗菌肽enterocin?A的基因同源性達到99％，則為乳酸菌IIa類抗菌肽；

其中，步驟一中Group-5F的核苷酸序列為：5′-GACACAACTTATCTATGGGG-3′；Group-5R的核苷酸序列為：5′-TACAAGTAGTTGCCTTGGCC-3′。

2.根據權利要求1所述的一種乳酸菌IIa類抗菌肽的PCR篩選方法，其特征在于步驟一中PCR擴增的反應體系為20μL反應體系，由下列成分組成：

PCR擴增條件為：94℃預變性2min，94℃變性15s，50℃退火30s，72℃延伸15s，共35個循環，再72℃延伸5min，4℃保溫。