[發明專利]一種用于表征外周調節性T細胞抑制活性的特征細胞群的檢測方法及其應用

有效

• 申請號: 201310150133.2
• 申請日: 2013-04-26
• 公開（公告）號: CN103235135A
• 公開（公告）日: 2013-08-07
• 發明（設計）人: 史其新
• 申請（專利權）人: 史其新
• 主分類號: G01N33/66
• 分類號: G01N33/66
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司 32206
• 代理人: 張慧清

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技術領域

本發明涉及醫藥領域，特別是涉及一種用于表征外周調節性T細胞抑制活性的特征細胞群的檢測方法及其應用，特別的說是一種用于表征調節性T細胞抑制活性變化和靶向組織免疫應答機制及其應用，是發現一種用于表征調節性T細胞中具有抑制活性的細胞群的狀態變化而介導靶向組織免疫應答之間的機制，及其在用于動態監測調節性T細胞抑制活性試劑盒中的應用、及在用于制備篩選胰腺早期病變靶標的試劑盒中的應用。

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背景技術

研究發現自體免疫性糖尿病是一種自發免疫性疾病并呈現漸進性發展過程，由于免疫調節活性下降，降低其對內源性效應T?細胞的抑制效應，由效應T?細胞而介導的特異性攻擊胰島β細胞－即體內唯一合成分泌胰島素的單位，因此，胰島破壞的結果直接造成胰島素分泌數量減少，而胰島素的功能將血中的葡萄糖運至相應的細胞內，供細胞正常生理活動需要。胰島素數量減少又直接影響到血中的葡萄糖代謝利用。當80≈90％的胰島被破壞使得胰島素分泌數量降至臨界值時，尚存的內源性胰島素無法維持生理所需的糖代謝，血中的葡萄糖異常升高，此時發展成為臨床期的1?型糖尿病。疾病發展至此，病人表現出相應的臨床癥狀和體征，實驗室檢查發現血液和尿液中的葡萄糖值升高，以及其它的一些輔助檢查都可以幫助診斷，但主要是依據血糖的升高程度診斷糖尿病。

目前對1?型糖尿病的發病機制和診治中存在局限；首先，雖然學術界對外周免疫耐受失衡是造成自體免疫病發生的成因已經有共識，即耐受平衡調節的關鍵取決于免疫調節細胞群的表達，但一些科學實驗中發現免疫調節細胞群高低與它應具備的調節功能間存在矛盾，研究發現免疫調節細胞的數量高低與它應該發揮的作用無關（Anne?Cooke?英國劍橋大學?發表在國際免疫學雜志），免疫調節細胞群中存在“僵尸細胞”，因此如何界定具有確切調節功能活性的靶位成為關鍵；其次，由于血糖持續的異常升高受到很多因素的影響，波動較大且容易有誤差，而且只有在胰島被破壞減少到臨界值后，內在的病變發展至臨床期后才表現出來。因此，不能全面和系統體現疾病的發生和進展，尤其無法反映免疫攻擊胰島細胞的早期病變，另外，胰腺組織活檢雖然可以反映病變局部的病理變化，它卻受到活檢帶來的手術創傷等并發癥以及無法被醫生和患者接受的制約。

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發明內容

本發明突破目前自體免疫病發病機制研究中的困局，解決了單純依賴外周免疫調節細胞表達量的高低無法客觀體現它實際發揮的調節功能間的矛盾，找到特異性靶位可以科學地反映調節性T細胞免疫抑制活性，并進一步公開了相應的細胞群檢測方法，從而實現動態監測調節性T細胞抑制活性狀態，以及作為篩選自體免疫糖尿病的靶器官胰腺早期病變的靶標，奠定了重要的基礎。

具體地，本發明公開了一種用于表征外周調節性T細胞抑制活性的靶向細胞群的檢測方法，包括以下步驟：

步驟1）將待測樣本處理，形成單細胞懸液；具體來說，將待測外周血或動物脾臟按照常規方法處理，去紅細胞過濾后制備得到淋巴細胞懸液；

步驟2）特征細胞群的抗體染色：

將上述單細胞懸液分別與標記不同熒光的單抗體CD3、CD4、?CD69混勻，冰上孵育30分鐘;?

步驟3）混合液PBS洗液調勻，加入細胞破膜裂解液，混勻冰上孵育30分鐘，再用細胞破膜輔液，充分混勻后離心，去上清；

步驟4）新鮮配制脫氧核糖核酸酶液，加入到步驟4）中所得沉淀中，混勻后孵育60分鐘，再用細胞破膜輔液，充分混勻后離心，去上清，

步驟5）加入抗體Fc阻斷劑，充分作用20分鐘；

步驟6）分別加入檢測標記調節細胞表位的轉錄因子（FoxP3）和脫氧核糖核酸（BrdU）復制的抗體；?所述的BrdU、FoxP3分別采用不同熒光標記，分取1.5μl抗體冰上孵育30分鐘，再用細胞破膜輔液200μl，洗滌細胞懸液，充分混勻后離心，去上清；

步驟7）流式細胞儀檢測：

加入流式細胞洗液充分混勻后離心，去上清，加入500ul流式細胞洗液，流式細胞儀檢測得到染色的活性調節性T細胞的占比。

進一步地，本發明還公開了所述步驟2）中，單細胞懸液與標記了不同熒光的單抗體的混合比例分別為：單細胞懸液與CD3以體積計算為1：400、單細胞懸液與CD4以體積計算為?1：200、單細胞懸液與CD69以體積計算為1：150；單細胞懸液與BrdU以體積質量比計算為1.5ul：1?ug、?單細胞懸液與?FoxP3以體積質量比計算為1.5ul：1ug。