[發明專利]一種用于表征外周調節性T細胞抑制活性的特征細胞群的檢測方法及其應用

有效

• 申請號: 201310150133.2
• 申請日: 2013-04-26
• 公開（公告）號: CN103235135A
• 公開（公告）日: 2013-08-07
• 發明（設計）人: 史其新
• 申請（專利權）人: 史其新
• 主分類號: G01N33/66
• 分類號: G01N33/66
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司 32206
• 代理人: 張慧清

1.一種用于表征外周調節性T細胞抑制活性的特征細胞群的檢測方法，其特征是該方法包括以下步驟：

步驟1）將待測樣本處理，形成單細胞懸液；

步驟2）特征細胞群的抗體染色：

將上述單細胞懸液分別與熒光抗體CD3、CD4、CD69混合；

步驟3）混合液以流式細胞洗液調勻，加入細胞破膜裂解液，混勻冰上孵育30分鐘，再用細胞破膜輔液，充分混勻后離心，去上清；

步驟4）新鮮配制脫氧核糖核酸酶液，加入到步驟4）中所得沉淀中，混勻后孵育60分鐘，再用細胞破膜輔液，充分混勻后離心，去上清，

步驟5）加入抗體Fc阻斷劑，充分作用20分鐘；

步驟6）分別加入檢測標記調節細胞表位的轉錄因子（FoxP3）和脫氧核糖核酸復制（BrdU）的抗體；?所述的BrdU、FoxP3分別采用不同熒光標記，分取1.5μl抗體冰上孵育30分鐘，再用細胞破膜輔液200μl，洗滌細胞懸液，充分混勻后離心，去上清；

步驟7）流式細胞儀檢測：

加入流式細胞洗液500ml，充分混勻后離心，去上清，加入流式細胞洗液，流式細胞儀上機檢測。

2.?根據權利要求1所述的一種用于表征外周調節性T細胞抑制活性的特征細胞群的染色檢測方法，其特征是：所述步驟2）中，單細胞懸液與熒光抗體的稀釋比例分別為：單細胞懸液與CD3以體積計算為1：400、單細胞懸液與CD4以體積計算為?1：200、單細胞懸液與CD69以體積計算為1：150,?不同比例稀釋后達到體積重量比為1ul：1?ug；?而單細胞懸液與BrdU以體積質量比計算為1.5ul：1?ug、?單細胞懸液與?FoxP3以體積質量比計算為1.5ul：1ug。

3.?根據權利要求1所述的一種用于表征外周調節性T細胞抑制活性的特征細胞群的檢測方法，其特征是：步驟1）中所述單細胞懸液的終濃度為1×10⁷/ml。

4.?根據權利要求1所述的一種用于表征外周調節性T細胞抑制活性的特征細胞群的檢測方法，其特征是：所述步驟2）中，細胞懸液與CD3、CD4、CD69在4℃的條件下結合孵育30分鐘，再用PBS洗滌2次。

5.?根據權利要求1所述的用于表征外周調節性T細胞抑制活性的特征細胞群的檢測方法，其特征是：所述步驟4）中，所得沉淀用細胞破膜輔液重復洗滌一次，混勻后離心，去上清。

6.?權利要求1至5中任意一項所述的檢測方法在用于制備調節性T細胞抑制活性檢驗試劑盒中的應用。

7.?權利要求1至5中任意一項所述的檢測方法在用于制備篩選胰腺早期病變靶標的試劑盒中的應用。