[發明專利]基于DNA自組裝的非酶SNP檢測方法

有效

• 申請號: 201310145787.6
• 申請日: 2013-04-24
• 公開（公告）號: CN103290111A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發明（設計）人: 曾令文;吳薇;陳俊華
• 申請（專利權）人: 中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 方振昌

技術領域

本發明一種核酸檢測方法，特別涉及一種基于DNA自組裝的非酶檢測方法。

背景技術

單核苷酸多態性（Single?Nucleotide?Polymorphism，SNP）是指基因組DNA序列中由于單個核苷酸（A，G，C，T）替換而引起的多態性，它是一種單核苷酸的變異。

SNP具有遺傳穩定性高、位點豐富且分布廣泛，易于實現自動化分析，位于基因內部編碼區的SNPs可能導致蛋白功能異常，與遺傳病和病變密切相關。因此，SNP研究越來越受到人們的重視，被廣泛應用于生物、農業、醫學、生物進化等眾多領域，是目前最具發展潛力的分子標記。

在醫藥學研究中，如果得出某些SNP或某些SNP的特定組合與特定疾病、特定地區發病人群乃至個別患者有明顯相關性，疾病的診斷和治療將可以更有針對性，甚至做到個體化。近幾年來，SNP篩查在遺傳病的研究，藥學的應用研究，以及腫瘤研究中都得到應用。

傳統的方法用于SNP檢測主要有單鏈構象多態性分析(single-strand?conformation?polymorphism,?SSCP)，能量轉移標記的等位特異PCR?（PCR-RFLP），分子信標?（molecular?beacons），變性高效液相色譜(denaturing?high?performance?liquid?chromatography,?DHPLC)，焦磷酸測序(pyro-sequencing)等。但是這些方法操作比較麻煩，費時耗力，不利于SNP的快速檢測。

近幾年來SNP的篩查方法取得了很大的進展，但大都以PCR方法為基礎，結合電泳技術，或結合熒光、質譜、酶聯免疫等方法，如寡核苷酸連接分析（oligonucleotide?ligation?assay，OLA），等位基因特異性寡核苷酸探針雜交法（allele-specific?oligonucleotide?hybridization，ASO）。雖然與傳統的方法相比，這些新技術操作方便，檢測靈敏度高，但是它們都需要用到實驗室特定的儀器，需要專業的技術人員，而且儀器價格昂貴，難以推廣到所有實驗室應用。因此發明一種簡單、便宜、快速的方法可以準確且高通量的對SNP進行篩查具有重要的意義。

發明內容

本發明的目的在于提供一種基于DNA自組裝的非酶核酸檢測方法，本發明方法不應用于疾病的診斷及治療。

本發明的另一個目的在于提供實現上述檢測方法的試劑盒。

本發明所采取的技術方案是：

基于DNA自組裝的非酶檢測SNP?的方法，包括如下步驟：

1)??????設計分離捕獲探針CP、單鏈MP、探針AP1和AP2，其中：

CP和MP可分別和目標序列的5’端和3’端互補為雙鏈，在形成的雙鏈中，CP和MP之間存在單鏈缺刻，該單鏈缺刻左側或右側的核苷酸與目標序列的SNP位點互補；

CP的一個末端連接有分離標記；

自組裝AP1的5’端和3’端可分別和AP2的3’端和5’端互補，自組裝形成雙鏈DNA，AP1和AP2的5’端和3’端中至少部分序列可與MP的一端互補為雙鏈；

2)??????將CP、MP、核酸連接酶和樣本加入反應液中，混勻，反應完全；

3)??????將反應液中生成的雙鏈DNA解鏈為單鏈DNA；

4)??????將連接有分離標記的單鏈DNA分離，清洗去除其他游離DNA鏈；

5)??????將清洗后的帶分離標記的單鏈DNA、AP1、AP2加入反應液，反應完全以形成自組裝雙鏈；

6)??????將連接有分離標記的DNA鏈分離，清洗去除其他游離DNA鏈；

7)??????通過檢測清洗后的DNA鏈中雙鏈DNA的量，確定SNP的量。

CP和MP的長度獨立為15～30bp。

AP1和和AP2的長度獨立為20～50?bp。

該方法中，分離標記為親合基團、固相載體。

該方法中，核酸連接酶選自?T4?DNA連接酶、E.coli?DNA連接酶、Tsc?DNA連接酶。

優選的，將清洗后的DNA鏈與特異性嵌入雙鏈DNA中的熒光染料反應，之后檢測其熒光值確定雙鏈DNA的量。

優選的，通過加熱之后急冷將雙鏈DNA解鏈為單鏈DNA。

實現上述檢測方法的試劑盒，該試劑盒中含有CP、MP、AP1和AP2。

本發明的有益效果是：

（1）本發明體系中無需加入聚合酶進行信號擴增，減少了背景信號。