[發明專利]一種MDCK細胞改良傳代方法

無效

• 申請號: 201310142688.2
• 申請日: 2013-04-24
• 公開（公告）號: CN103215219A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發明（設計）人: 任莉娜;張崇華;杜溪喬
• 申請（專利權）人: 哈爾濱市疾病預防控制中心
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 高會會

技術領域

本發明涉及動物組織培養技術領域，MDCK細胞（狗腎細胞）主要用于流感病毒的分離。

背景技術

流感病毒所導致的流行性感冒（簡稱流感）是WHO第1個實行全球監測的傳染病，是預防控制流感的策略和措施之一，其中流感毒株的分離對于流感監測具有非常重要的意義，作為國家流感監測的網絡實驗室，通過對所在監測地區的流感病毒的分離掌握最新的流感流行趨勢，為疫苗株的選擇制備做好流感疫情預報。

目前在基層的流感監測網絡實驗室中用于流感病毒分離的MDCK細胞在20～35代之間，對于狀態良好長成單層的MDCK細胞，其傳代消化是關鍵技術，每一次傳代消化決定著細胞下一代的生長狀態及對流感病毒的分離效果。

目前,國內分離流感病毒主要采用MDCK細胞培養法，作為流感監測的網絡實驗室，每年都承擔著大量的流感病毒分離鑒定工作，實驗室需要培養大量的MDCK細胞，根據國家流感監測方案《流行性感冒診斷標準WS285-2008（附錄A）》進行一瓶MDCK細胞(培養瓶規格：T-75)傳代需要消化液（EDTA-胰酶）11mL、消化時間為12～17min,在工作中如果傳代細胞為5瓶，累計EDTA-胰酶用量在55mL、累計工作時間60～85mim，在實際工作中上述工作模式影響了工作質量、工作效率，增大了工作成本，因此建立更為有效的MDCK細胞傳代模式至關重要。

發明內容

本發明的目的是為了解決現有MDCK細胞培養法存在工作效率低、工作質量差以及工作成本高的問題，而提供了一種MDCK細胞改良傳代方法。

本發明的一種MDCK細胞改良傳代方法，是按照以下步驟進行的：

一、取培養瓶中培養的單層MDCK細胞，棄去培養瓶中培養液，用Hank’s平衡鹽溶液清洗MDCK細胞，棄掉洗液；

二、向步驟一培養瓶中清洗后的MDCK細胞加入1mL預熱的胰酶，放入37℃溫箱培養1min，棄掉胰酶；

三、重復步驟二操作1次；

四、向步驟三處理的MDCK細胞中加入1mL預熱的胰酶，放入37℃溫箱培養1～4min，期間顯微鏡下觀察細胞狀態，若細胞出現明顯細胞間隙時終止消化過程，棄掉胰酶；

五、向步驟四處理后的MDCK細胞中加入0.2mL胎牛血清中和殘余胰酶的活性，再補入8mL的細胞培養液，混勻制成細胞懸液分裝至T-25細胞瓶中，在37℃溫箱培養，隔天更換細胞培養液，待MDCK細胞長成單層后停止培養，即完成MDCK細胞改良傳代；其中，步驟五中所述的細胞培養液為：每1mL細胞培養液含有0.84mL的MEM、0.11mL的胎牛血清、0.012mL的L-谷氨酰胺、0.01mL的青鏈霉素和0.015mL的羥乙基哌嗪乙硫磺酸。

本發明包含以下有益效果：

MDCK細胞傳代消化過程中需要消化液（即EDTA-胰酶），EDTA-胰酶在37℃時消化效果是最佳的，消化前胰酶應37℃預熱，細胞消化溫度同時控制在37℃，消化過程中應更換胰酶，始終使胰酶保持對細胞最有效的消化作用；同時細胞培養液中的胎牛血清可以中和胰酶的消化作用，因此在對細胞進行消化前應用洗液清洗培養瓶中殘留的培養液，減少殘留培養液的胎牛血清對胰酶的中和作用。根據實際工作的需要，改良的MDCK細胞傳代技術，在傳代一瓶MDCK細胞的過程中只需要3mL的EDTA-胰酶及3～6min的消化時間；在流感流行季節，實際工作中平均每一次需要5瓶細胞傳代，改良的傳代技術可以累計節約40mLEDTA-胰酶、節省45～55min的工作時間。

本發明提高了工作質量和工作效率、節約有效工作時間、降低了實驗成本，同時提高了流感病毒分離效率。本發明每傳代消化一瓶（T-75）MDCK細胞與國家流感監測方案《流行性感冒診斷標準WS285-2008（附錄A）》相比節省9～11min,節約8mL胰酶。

每傳代消化一瓶（T-75）MDCK細胞與國家流感監測方案《流行性感冒診斷標準WS285-2008（附錄A）》相比節省9～11min,實際工作中平均每次傳代消化5瓶MDCK細胞以備流感病毒分離用，可累計節省45～55min有效工作時間。

每傳代消化一瓶（T-75）MDCK細胞與國家流感監測方案《流行性感冒診斷標準WS285-2008（附錄A）》相比節約8mL胰酶，在流感流行季節，實際工作中平均每次消化累計節約40mL胰酶。

具體實施方式

具體實施方式一：本實施方式的一種MDCK細胞改良傳代方法，是按照以下步驟進行的：