[發(fā)明專利]一株用于異麥芽酮糖生產(chǎn)的甘蔗克雷伯菌

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310142534.3
• 申請(qǐng)日: 2013-04-23
• 公開（公告）號(hào): CN103509733B
• 公開（公告）日: 2016-11-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李憲臻
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 李憲臻
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12P19/18;C12R1/22
• 代理公司: 上海京滬專利代理事務(wù)所(普通合伙) 31235
• 代理人: 周曉玲

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明專利涉及一種微生物菌，能夠合成α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，催化蔗糖生物轉(zhuǎn)化為異麥芽酮糖，用于異麥芽酮糖生產(chǎn)。

背景技術(shù)

異麥芽酮糖(α-D-吡喃葡糖基-1,6-D-果糖,Isomaltulose),又稱帕拉金糖,是一種葡萄糖和果糖以α-1,6-糖苷鍵結(jié)合形成的還原性二糖,天然存在于蜂蜜,但是含量極低。作為蔗糖的異構(gòu)體,其口感和物理性質(zhì)與蔗糖非常相似,而甜度只有蔗糖的一半。由于異麥芽酮糖特殊的生理功能，作為一種健康食品添加劑，在特定條件下可以作為蔗糖替代品應(yīng)用于食品工業(yè)。

異麥芽酮糖幾乎不能被牙菌斑形成細(xì)菌尤其是可變鏈球菌所利用,并且能減少不溶性葡聚糖及其酸的生成,從而防止可變鏈球菌吸附到牙齒表面并減少牙釉質(zhì)的局部脫鈣作用，具有防齲齒活性。異麥芽酮糖在人體內(nèi),只能被小腸處的腸道微生物分解成葡萄糖和果糖而被消化吸收，但由于其分解速度很慢,攝入異麥芽酮糖后,能長時(shí)間緩慢提供能量，而不會(huì)引起血液中葡萄糖和胰島素的急速上升,從而成為糖尿病患者的健康食品。同時(shí),健康人或糖尿病患者食用異麥芽酮糖不會(huì)引起任何胃腸不適和血脂變化。

異麥芽酮糖是以蔗糖為原料，經(jīng)微生物合成的α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（EC.5.4.99.11）催化蔗糖異構(gòu)化后而得到的，迄今已發(fā)現(xiàn)某些微生物能夠?qū)⒄崽寝D(zhuǎn)化為異麥芽酮糖，如Serratia、Erwinia、Protaminobacter和Klebsiella等幾個(gè)細(xì)菌屬中的微生物種，具代表性的菌種主要包括Protaminobacter?rubrum、Serratia?plymuthica和Klebsiella?planticola。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的微生物中多數(shù)催化產(chǎn)物以異麥芽酮糖為主（75-80%）,但同時(shí)也伴隨有海藻酮糖和葡萄糖與果糖形成。其中的葡萄糖和果糖的存在嚴(yán)重影響異麥芽酮糖的產(chǎn)品質(zhì)量和功能性，必須采用樹脂分離等技術(shù)分離除去，導(dǎo)致生產(chǎn)成本大幅提高，因此,α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶催化蔗糖異構(gòu)化產(chǎn)物的多樣性成為異麥芽酮糖工業(yè)生產(chǎn)的主要障礙。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種高效生產(chǎn)異麥芽酮糖的微生物菌，能夠?qū)⒄崽侵苯愚D(zhuǎn)化為異麥芽酮糖，而產(chǎn)物中僅有極低濃度的葡萄糖和果糖。

本發(fā)明是一種命名為LI8的甘蔗克雷伯菌，是一株純培養(yǎng)細(xì)菌株，分類學(xué)鑒定為甘蔗克雷伯菌（Klebsiella?sugarcanna），保藏編號(hào)為：CCTCC?M?2013153，該菌株能夠合成α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，在催化蔗糖異構(gòu)化為異麥芽酮糖的產(chǎn)物中，異麥芽酮糖含量為88.9％，海藻酮糖為10.3%，葡萄糖和果糖為0.8%。其技術(shù)解決方案為：

通過從甘蔗根部收集土壤樣品、在蔗糖固體平板上稀釋涂平板分離單菌落、蔗糖液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)、薄層層析（TLC）檢測異麥芽酮糖的合成和高效液相色譜（HPLC）法分析檢測蔗糖異構(gòu)化產(chǎn)物中各種糖組分比例等步驟，獲得異麥芽酮糖生產(chǎn)菌。

本發(fā)明中所述的甘蔗克雷伯菌（Klebsiella?sugarcanna），在2013年4月19日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC?M?2013153，保藏單位地址為：武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)，郵編：430072。

對(duì)于上述技術(shù)方案中，所述的從土壤中分離甘蔗克雷伯菌的步驟包括：

將從甘蔗根部收集的土壤樣品懸浮于無菌生理鹽水中，在蔗糖固體平板上進(jìn)行系列稀釋涂平板，在30°培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，挑取單菌落接種到蔗糖液體培養(yǎng)基中，并在30°C搖床中振蕩培養(yǎng)（150轉(zhuǎn)/分）過夜，薄層層析法檢測發(fā)酵上清液中是否含有異麥芽酮糖。用高效液相色譜分析檢測產(chǎn)生異麥芽酮糖的培養(yǎng)上清液中的糖組分比例，選取一株能夠產(chǎn)生最高濃度異麥芽酮糖且葡萄糖和果糖含量較低的單菌落用于本發(fā)明，并命名為LI8，該菌落在蔗糖固體平板上的形態(tài)特征為圓形、光滑、白色不透明。其中，

所述蔗糖固體平板培養(yǎng)基組成為：20～25g蔗糖，4.5～5.5g酵母粉，0.45～0.55g硫酸鎂，0.8-1.0g磷酸氫二鉀，15-20g瓊脂，1000g水，pH7.0～7.2。

所述蔗糖液體培養(yǎng)基組成為：38～42g蔗糖，4.5～5.5g蛋白胨，3.5～4.5g酵母粉，1000g水，pH7.0～7.2。

所述薄層層析法為：取0.5μl發(fā)酵上清液點(diǎn)樣在硅膠薄層層析板上，于展開槽中展開后顯色，展開劑組成為乙酸乙酯-乙酸-水的體積比4:3:0.8，顯色劑為本胺（4％）-二本胺（4％）-磷酸（85％）的體積比5:5:1，顯色溫度為80°C，顯色時(shí)間為5分鐘，異麥芽酮糖形成典型的黃綠色斑點(diǎn)。