[發明專利]一種小分子量方格星蟲纖溶酶及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201310142498.0
• 申請日: 2013-04-23
• 公開（公告）號: CN103205411A
• 公開（公告）日: 2013-07-17
• 發明（設計）人: 林祥志;馬伏寧;林汝榕;陳水波;楊善軍;王昭凱;馬勇;柯秀蓉;李惠麗
• 申請（專利權）人: 國家海洋局第三海洋研究所
• 主分類號: C12N9/68
• 分類號: C12N9/68;A61K38/48;A61P7/02
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種小分子量方格星蟲纖溶酶及其制備方法與應用。

背景技術

血栓性疾病(thrombotic?disease，TD)危害心、腦、肺的血管系統，造成急性心肌梗塞、腦梗塞、腦血栓形成、肺動脈栓塞、肢體靜脈血栓等疾病。目前臨床上用于血栓預防和治療的藥物主要分為3類：抗血小板藥物、抗凝藥物和溶栓藥物。現有溶栓藥物還存在缺乏特異性、出血副作用強、藥劑量難以控制、半衰期短、易出現再栓塞等問題。

方格星蟲（Sipunculus?nudus）是一種海洋底棲無脊椎動物，隸屬于星蟲動物門（Sipuncula），方格星蟲綱（Sipunculida），星蟲科，方格星蟲屬動物。生活在沿海灘涂一帶沙泥底質的海域，漲潮時鉆出，退潮時潛伏在沙泥洞中，俗稱沙蟲、光裸星蟲、沙腸子。已報導的大約有300種隸屬為全球分布種類，在我國沿海均有分布。星蟲有較高藥用功效和食療價值。它性寒，味甘、咸，有滋陰降火、清肺補虛之功效。星蟲體內富含多種活性物質，具有抗擊疲勞、延緩衰老、增強免疫力、滋陰降火以及清肺化痰等功效。

國內外對方格星蟲的研究主要集中在形態解剖學特征、繁殖生物學及生理生化等方面。關于星蟲纖溶酶相關專利有李肖肖、雷丹青等從方格星蟲中提取的纖溶酶（專利號：CN101892210A）其分子量在27-35kDa之間。牛榮麗、唐景財廖共山等從革囊星蟲內臟中提取出具有激酶和直接溶解纖維蛋白活性的纖溶酶（專利號：CN102002488A）其分子量在28-32kDa之間。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種方格星蟲纖溶酶。

本發明提供的方格星蟲纖溶酶，為具有如下1）或2）特征的纖溶酶：1）其分子量為20KDa-25KDa；2）等電點為3.0-3.5。

上述方格星蟲纖溶酶，為具有如下1）或2）特征的纖溶酶：1）其分子量為24917Da；2）等電點為3.211。

本發明的另一個目的是提供一種制備上述方格星蟲纖溶酶的方法。

本發明提供的方法，包括如下步驟：

1）將離體的方格星蟲內臟依次進行勻漿、鹽析，收集鹽析產物；

2）將所述鹽析產物依次經離子交換柱層析和凝膠柱層析，得到方格星蟲纖溶酶。

上述方法中，所述離子交換柱層析為陰離子交換柱層析；

所述陰離子交換柱層析為將所述鹽析產物流經陰離子交換柱，用含0.1-1M?NaCl的濃度為0.02M、pH值為7.8的Tris-HCl緩沖液進行線性梯度洗脫，檢測陰離子交換柱洗脫產物活性，收集具有活性的陰離子交換柱層析洗脫產物；所述線性洗脫的時間為20h，所述線性洗脫的流速為0.5mL/min；所述陰離子交換柱具體為DEAE-Sepharose?FF，

所述凝膠柱層析為將所述陰離子交換柱洗脫產物流經葡聚糖凝膠柱，用濃度為0.02M、pH值為7.5的PBS緩沖液洗脫，檢測葡聚糖凝膠柱洗脫產物活性，收集具有活性的凝膠柱層析洗脫產物；所述洗脫的時間為6h，所述洗脫的流速為1mL/min；所述葡聚糖凝膠柱具體為Sephadex?G-50，

所述檢測洗脫產物活性采用的方法具體為纖維素蛋白平板檢測，若形成透明圈，則有活性。

上述收集具有活性的陰離子交換柱層析洗脫產物為每10min收集一管洗脫產物，收集第45-50管洗脫產物；

上述收集具有活性的凝膠柱層析洗脫產物為每10min收集一管洗脫產物，收集第18-22管洗脫產物。

上述方法中，步驟2）中，在所述離子交換柱層析步驟前，還包括將所述鹽析產物溶解后透析除鹽的步驟；所述溶解采用的pH值為7.5、濃度為0.02mol/L的PBS緩沖液。

在所述陰離子交換柱層析中，在所述檢測陰離子交換柱洗脫產物活性的步驟前還包括：將線性梯度洗脫的產物透析除鹽的步驟；

在所述凝膠柱層析中，在收集具有活性的凝膠柱層析洗脫產物的步驟后還包括：將所述具有活性的凝膠柱層析洗脫產物透析除鹽、干燥，得到方格星蟲纖溶酶的步驟。

上述方法中，所述透析采用截留分子量為10kDa的透析袋。上述干燥為冷凍干燥。

上述方法中，步驟1），所述勻漿為將所述方格星蟲的內臟與pH為7.5、濃度為0.02mol/L的磷酸緩沖液混勻后勻漿，離心收集上清液A；

所述鹽析包括如下步驟：

A、向所述上清液A加入硫酸銨至質量百分含量為30%，混勻、靜置、離心收集上清液B；