[發明專利]一種小分子量方格星蟲纖溶酶及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201310142498.0
• 申請日: 2013-04-23
• 公開（公告）號: CN103205411A
• 公開（公告）日: 2013-07-17
• 發明（設計）人: 林祥志;馬伏寧;林汝榕;陳水波;楊善軍;王昭凱;馬勇;柯秀蓉;李惠麗
• 申請（專利權）人: 國家海洋局第三海洋研究所
• 主分類號: C12N9/68
• 分類號: C12N9/68;A61K38/48;A61P7/02
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

1.一種方格星蟲纖溶酶，為具有如下1）或2）特征的纖溶酶：1）其分子量為20KDa-25KDa；2）等電點為3.0-3.5。

2.根據權利要求1所述的方格星蟲纖溶酶，其特征在于：所述方格星蟲纖溶酶，為具有如下1）或2）特征的纖溶酶：1）其分子量為24917Da；2）等電點為3.211。

3.一種制備權利要求1或2所述方格星蟲纖溶酶的方法，包括如下步驟：

1）將離體的方格星蟲內臟依次進行勻漿、鹽析，收集鹽析產物；

2）將所述鹽析產物依次經離子交換柱層析和凝膠柱層析，得到方格星蟲纖溶酶。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：所述離子交換柱層析為陰離子交換柱層析；

所述陰離子交換柱層析為將所述鹽析產物流經陰離子交換柱，用含0.1-1M?NaCl的濃度為0.02M、pH值為7.8的Tris-HCl緩沖液進行線性梯度洗脫，檢測陰離子交換柱洗脫產物活性，收集具有活性的陰離子交換柱層析洗脫產物；所述線性洗脫的時間為20h，所述線性洗脫的流速為0.5mL/min；

所述凝膠柱層析為將所述陰離子交換柱洗脫產物流經葡聚糖凝膠柱，用濃度為0.02M、pH值為7.5的PBS緩沖液洗脫，檢測葡聚糖凝膠柱洗脫產物活性，收集具有活性的凝膠柱層析洗脫產物；所述洗脫的時間為6h，所述洗脫的流速為1mL/min；

所述檢測洗脫產物活性采用的方法具體為纖維素蛋白平板檢測。

5.根據權利要求4所述的方法，包括如下步驟：

所述陰離子交換柱為DEAE-Sepharose?FF；

所述葡聚糖凝膠柱為Sephadex?G-50。

6.根據權利要求4或5所述的方法，其特征在于：

步驟2）中，在所述離子交換柱層析步驟前，還包括將所述鹽析產物透析除鹽的步驟；

在所述陰離子交換柱層析中，在所述檢測陰離子交換柱洗脫產物活性的步驟前還包括：將線性梯度洗脫的產物透析除鹽的步驟；

在所述凝膠柱層析中，在收集具有活性的凝膠柱層析洗脫產物的步驟后還包括：將所述具有活性的凝膠柱層析洗脫產物透析除鹽、干燥，得到方格星蟲纖溶酶的步驟；

所述透析具體采用截留分子量為10kDa的透析袋。

7.根據權利要求3－6中任一所述的方法，其特征在于：

步驟1），所述勻漿為將所述方格星蟲的內臟與pH為7.5、濃度為0.02mol/L的磷酸緩沖液混勻后勻漿，離心收集上清液A；

所述鹽析包括如下步驟：

A、向所述上清液A加入硫酸銨至質量百分含量為30%，混勻、靜置、離心收集上清液B；

B、向所述上清液B中加入硫酸銨至質量百分含量為70%，混勻、靜置、離心，收集沉淀，得到鹽析產物。

8.根據權利要求7所述的制備方法，其特征在于：

所述方格星蟲的內臟與所述磷酸緩沖液的配比為250g：1L；

所述勻漿在0-4℃條件下進行；所述勻漿具體在0℃條件下進行；

所述靜置均為4-10℃靜置2-8h，所述靜置均具體為4℃靜置2h；

所述離心均為在4-10℃、離心力為4000-8000g下離心10-30min；所述離心均具體為在4℃、離心力為5000g下離心10min。

9.由權利要求3-8任一所述的方法制備得到的方格星蟲纖溶酶：所述方格星蟲纖溶酶分子量具體為24917Da、等電點具體為3.211。

10.權利要求1或2或9所述的方格星蟲纖溶酶在降解纖維蛋白原中的應用。