[發明專利]一種快速提取高純度質粒DNA的方法

無效

• 申請號: 201310142265.0
• 申請日: 2013-04-23
• 公開（公告）號: CN103205417A
• 公開（公告）日: 2013-07-17
• 發明（設計）人: 韓典霖;俞萍;李曉晨;孫克非
• 申請（專利權）人: 天根生化科技（北京）有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12R1/19
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 羅文群

技術領域

本發明涉及一種快速提取高純度質粒DNA的方法，屬于核酸純化技術領域。

背景技術

質粒DNA的提取和純化是分子生物學的基本步驟之一，涉及了基因克隆、基因序列分析、核酸疫苗、基因治療和各種基因重組等領域。從原核生物中提取和純化質粒DNA的經典步驟為：菌體裂解、質粒分離和純化。目前菌體裂解最常用的方法有：一步法質粒提取法和堿裂解法。一步法質粒提取法是由德國Eppendorf公司發明。它是一種基于溶菌酶裂解細菌的提取方法。該方法使用含有溶菌酶和去污劑的裂解液裂解細胞，裂解產物澄清無粘性，裂解后無需離心可直接與過濾膜進行結合，然后通過快速離心的清洗和洗脫得到超螺旋的質粒DNA。該提取方法雖然方便，快捷和重復性好，但不適合于低拷貝質粒的提取和豐富培養基培養大腸桿菌質粒的提取。堿裂解法質粒DNA純化技術是1979年由Birnboim&Doly發明。該方法仍是分子克隆研究中最常用的方法之一，其操作包括三種溶液處理，一般需要20分鐘左右的時間才能完成質粒的提取。該提取方法適用面較廣，重復性好，但實驗周期相對較長，影響了研究者的實驗進程。

發明內容

本發明的目的是提出一種快速提取高純度質粒DNA的方法，基于已有的堿裂解法，采用一種新的快速沉淀緩沖液，并對整個質粒提取流程進行優化，以使整個質粒提取過程大大縮短。

本發明提出的快速提取高純度質粒DNA的方法，包括以下各步驟：

（1）對1～3毫升培養12～16小時的大腸桿菌菌液進行離心分離，離心分離的轉速為13000轉/分鐘，離心分離的時間為1分鐘，取出離心分離的沉淀物；

（2）向步驟（1）的沉淀物中加入75微升懸浮液，懸浮液的成分為：50毫摩爾葡萄糖、25毫摩爾三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽和10毫摩爾乙二胺四乙酸，渦旋振蕩至沉淀完全溶解，得到第一溶液；

（3）向上述第一溶液中加入75微升堿裂解液，堿裂解液的成分為：200毫摩爾氫氧化鈉和重量體積比為1%的十二烷基硫酸鈉，上下翻轉6～8次，使步驟（2）中所得到的菌體充分裂解，得到第二溶液；

（4）向第二溶液中加入210微升快速沉淀緩沖液，上下翻轉6～8次，充分混勻，對混合物進行離心分離，離心分離的轉速為13000轉/分鐘，離心分離時間為1分鐘；

所述的快速沉淀緩沖液中各組分的質量為：

將上述各組分稱重后混合，加去離子水，得到混合液，并使混合液體積為100毫升；

（5）將步驟（4）中離心分離得到的上清液轉入硅膜吸附柱中，進行吸附離心，吸附離心的轉速為13000轉/分鐘，吸附離心時間為30秒，倒去廢液；

（6）向步驟（5）的硅膜吸附柱中加入300微升漂洗液，漂洗液的成分為10毫摩爾三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽以及體積百分比為75%的無水乙醇，漂洗液的pH值為7.5，進行脫鹽離心，脫鹽離心的轉速為13000轉/分鐘，脫鹽離心時間為30秒，倒去廢液；

（7）在步驟（6）的硅膜吸附柱中加入50～100微升洗脫緩沖液，洗脫緩沖液為10毫摩爾三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，洗脫緩沖液的pH值為8，進行洗脫離心，洗脫離心的轉速為13000轉/分鐘，洗脫離心時間為30秒，得到高純度質粒DNA。

本發明提出的快速提取質粒DNA的方法，其優點是：

1、本發明提出的快速提取質粒DNA的方法，使用了一種新的快速沉淀緩沖液，并對整個質粒提取流程進行優化，快速沉淀緩沖液一方面中和氫氧化鈉；另一方面提高體系中的鹽濃度，使蛋白質、基因組DNA和RNA發生鹽析沉淀。加入快速沉淀緩沖液后，大部分蛋白質、基因組DNA和RNA都以不溶物狀態存在，離心1分鐘后即可將所有不溶物沉淀到管底，上清即可進行下一步操作。因此使質粒總核糖核酸的提取過程具有高效、快速、簡潔的特點，可以直接從大腸桿菌培養液中分離純化總核糖核酸，例如本發明方法的實施例1和實施例2中從1～3毫升大腸桿菌培養液中提取總核糖核酸，由傳統的20分鐘縮短到6分鐘左右。

2、使用本發明方法提取質粒核糖核酸，具有高效、快速、簡潔的特點，純化的質粒核糖核酸可適用于各種常規操作，包括酶切、PCR、測序、連接、轉化、文庫篩選、體外翻譯、轉染一些常規的傳代細胞等。

3、本發明的提取質粒DNA方法，不僅能用于高拷貝和低拷貝質粒的提取，也適用于不同培養基培養大腸桿菌質粒的提取，大大節省了實驗研究者的時間，提高了實驗效率。

附圖說明