[發明專利]一種以胚芽鞘節作為外植體的玉米再生體系的建立方法

無效

• 申請號: 201310140747.2
• 申請日: 2013-04-22
• 公開（公告）號: CN103190346A
• 公開（公告）日: 2013-07-10
• 發明（設計）人: 萬向元;方才臣;吳鎖偉;肖中華;張丹鳳;劉艷艷;徐媛媛;安學麗;王超
• 申請（專利權）人: 北京金冠豐生物技術有限公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明所屬的技術領域是農業生物技術領域和作物育種領域。

背景技術

玉米是世界五大作物之一，在我國乃至全世界的糧食生產中都占有舉足輕重的地位。在提高玉米單產的諸多因素中，新品種選育的作用約占40%。隨著分子生物學技術的長足發展，轉基因技術、單倍體技術等開始在玉米新品種選育中發揮重要的作用，它們具有許多不同于傳統育種技術的獨特優勢，因此受到了國內外育種工作者的高度重視。

轉基因技術是根據育種目標，利用現代生物技術手段從供體生物中分離目的基因，經DNA重組與遺傳轉化導入受體作物，經過篩選獲得穩定表達的轉基因株系，結合田間試驗與大田選擇育成轉基因新品種或新種質。轉基因育種最大的優點是針對性很強，可以根據目標性狀定向選擇合適的基因導入需要改良的作物中，以達到預期的目的。通過轉基因技術的應用，不僅可以提升傳統育種的研發效率，而且提升了育種研發的準確率、減少盲目性和重復浪費，豐富了傳統的育種手段，使作物育種的產業發展水平邁向新的臺階。目前，轉基因育種在大豆、玉米、棉花和油菜等作物中已經取得了巨大的成功，其中，轉基因玉米已經成為僅次于轉基因大豆的全球種植面積第二大的轉基因作物。

在研發轉基因作物新品種時，最重要的技術環節之一就是作物遺傳轉化技術。玉米常用的遺傳轉化方法主要是基因槍法和農桿菌介導法，這兩種轉化方法都需要首先建立玉米再生體系。

長期以來，常規的系譜法、回交法、復合雜交和輪回選擇等技術是改良玉米自交系的主要手段，已培育了許多能夠適應各種生態環境的優良雜交種，但常規遺傳改良一直存在育種周期長等缺點。1949年Chase提出了單倍體誘導選系的方法。原理是利用自然發生或人工培育的單倍體植株，經人工或自然加倍獲得純合的二倍體植株，再從中選育自交系。利用單倍體育種技術只需2?個世代便可得到純合的DH?系，極大地縮短了育種周期，提高了育種效率。近10年來，美國孟山都公司、德國KWS公司及俄羅斯等國的一些玉米種子公司都在嘗試利用單倍體誘發系進行自交系選育，其中以德國KWS公司的技術相對成熟。據不完全統計每年大約可產生1500-2000個純系。然而，玉米單倍體自然加倍和人工加倍的概率均比較低，一部分優良的基因型由于加倍不成功而丟失。如果將玉米單倍體技術和玉米組織培養再生技術相結合，通過孤雌生殖途徑得到單倍體，使用組織培養再生技術對單倍體進行擴繁，這樣就可以保證更多的單倍體得到加倍，盡可能減少由于加倍率低所造成育種材料的丟失。

從以上陳述可看出，玉米轉基因技術和單倍體技術中，組織培養再生體系的建立都是其關鍵的技術之一。玉米再生體系所用的材料可分為幼胚和非幼胚類型，其中前者還包括直接用幼胚或幼胚誘導的胚性愈傷組織進行再生體系的建立，而后者包括直接用莖尖分生組織和利用成熟胚、葉片、莖尖等誘導的胚性愈傷組織等作為材料進行再生。幼胚和幼胚誘導的胚性愈傷組織操作簡單，植株再生比較容易，是玉米轉基因中最常用的受體材料。但是轉基因所用的受體材料基因型限制嚴重、幼胚材料易受季節和溫室條件限制，不能夠持續不斷的高通量的進行玉米轉化，在產業化應用上具有很大的局限性。非幼胚類型的材料中，直接用莖尖分生組織雖然轉化和再生容易，且不受基因型限制，但轉化率低，獲得的再生植株大多是嵌合體，后代需要做大量的篩選工作。而采用成熟胚、葉片、莖尖等材料較難誘導出胚性愈傷組織，再生較困難。我們基于玉米胚芽鞘節作為材料建立的組織培養再生體系相對與玉米幼胚的轉化而言，轉化效率略低，但是由于其不受溫室條件和生長季節的限制，操作簡便，可以實現高通量、持續不斷的遺傳轉化，因而在玉米的商業化轉基因研發中，具有相當大的應用潛力。在單倍體應用方面，將玉米單倍體種子發芽后通過胚芽鞘節誘導愈傷組織，進而獲得再生植株，可有效對單倍體進行擴繁，為單倍體的加倍提供大量的材料。與成熟胚、葉片、莖尖等再生體系相比，玉米胚芽鞘節誘導胚性愈傷組織的效率較高，因此在玉米單倍體育種中能迅速獲得大量的單倍體，為加快育種進程打下堅實的基礎。

發明內容

本發明的目的在于提供一種以胚芽鞘節為外植體的玉米再生方法，包括以下步驟：

1）將滅菌的玉米種子置于發芽培養基中培養，萌發獲得幼苗；

2）從上述步驟1）中得到的幼苗上切取胚芽鞘節，接種于愈傷組織誘導培養基上誘導愈傷組織并繼代培養；

3）將上述步驟2）中得到的愈傷組織置于胚狀體誘導培養基中，得到玉米愈傷組織胚狀體；

4）將上述步驟3）中得到的愈傷組織胚狀體置于再生培養基中，得到再生苗；