[發明專利]一種檢測苯乙醇胺A含量的方法及檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201310140444.0
• 申請日: 2013-04-22
• 公開（公告）號: CN103265440A
• 公開（公告）日: 2013-08-28
• 發明（設計）人: 鄧安平;曹碧云;楊紅
• 申請（專利權）人: 蘇州大學
• 主分類號: C07C217/70
• 分類號: C07C217/70;C07C213/08;G01N33/566;C07K14/765;C07K14/77;C07K16/44
• 代理公司: 北京瑞思知識產權代理事務所(普通合伙) 11341
• 代理人: 李濤

技術領域

本發明屬于食品安全監督或食品分析的研究領域，涉及一種檢測苯乙醇胺A含量的酶聯免疫吸附分析方法(ELISA)，本發明還涉及相關檢測試劑盒。?

背景技術

β-腎上腺素受體激動劑（簡稱β-激動劑）是一類結構和生理功能類似于腎上腺素和去甲腎上腺素的苯乙醇類衍生物，因為能與動物體內的大多數組織細胞膜上的β-腎上腺素受體結合而得名。β-激動劑能顯著提高胴體的瘦肉率、增重和提高飼料轉化率。因此，β-激動劑被大量非法用于畜牧生產，其中最常用的有克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺等。在國內外已有多起因食用含β-激動劑殘留的動物肝或肺組織發生中毒的報道，出現頭痛、心動過速、血壓升高、狂躁不安等癥狀。因此，各國政府在動物飼養中都嚴禁使用β-激動劑。?

近年來瘦肉精中毒事件時有發生。最近又出現了一種新型瘦肉精：苯乙醇胺A。這種新型瘦肉精的出現，再次敲響我國食品安全警鐘。苯乙醇胺A又稱為克倫巴胺，化學結構式為2-[4-（4-硝基苯基）丁基-2-氨基]-1-甲氧基苯乙醇，英文名：Phenylethanolamine?A（PA），是一種人工合成的化學物質。克侖巴胺是美國禮來公司合成萊克多巴胺的副產物，具有同瘦肉精萊克多巴胺相同的作用和效果，屬于β-激動劑的一種，具有營養再分配作用。2010年底被農業部第1519號公告列為禁止在飼料和動物飲水中使用的物質。?

目前，苯乙醇胺A檢測方法多為色譜分析法。如：農業部第1486號公告-1-2010中的高效液相色譜-串聯質譜法測定飼料中的苯乙醇胺A。盡管色譜分析方法較準確，但液相色譜-串聯質譜儀價格昂貴、操作復雜，樣品預處理復雜、費時，檢測成本高，不適合大量樣品的快速篩選。?

酶聯免疫吸附分析方法(ELISA)具有靈敏度高、特異性強、分析快速的優點，己廣泛用于臨床、藥物、食品和環境等分析領域。因而，建立一種簡便高通量的應用于常規定量/篩選食品和飼料中苯乙醇胺A的ELISA分析方法具有十分重要?的實際應用意義。然而到目前為止，仍然缺少高靈敏度及高特異性的苯乙醇胺A的ELISA檢測法。?

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的不足而提供一種檢測苯乙醇胺A殘留的酶聯免疫吸附分析方法。?

本發明的目的還在于提供苯乙醇胺A殘留檢測的檢測試劑及檢測試劑盒。?

本發明研究發現，對苯乙醇胺A進行特定修飾，得到半抗原，再偶聯載體蛋白得到抗原，并作為免疫原免疫動物得到抗體，并由此建立的ELISA分析法能夠顯著提高檢測靈敏度和特異性。?

據此，為實現本發明的目的，本發明首先一種苯乙醇胺A半抗原，其具有式（I）所示的結構式：?

該半抗原是將苯乙醇胺A溶于無水乙醇中，升溫至80℃后加入水合肼、鈀碳，氮氣保護條件下80℃回流反應得到。其反應式如下：?

進而本發明提供苯乙醇胺A抗原，其為上述的半抗原與載體蛋白的偶聯復合物。?

該抗原的制備方法是將上述的苯乙醇胺A半抗原溶解于水中，緩慢滴加NaNO₂溶液，并用鹽酸調pH值為1.5，暗處4℃反應1～10小時，經初步測定重氮化完成之后，緩慢滴加尿素溶液終止反應，將上述重氮化溶液逐滴加入到0.01～0.02%的載體蛋白溶液中，調節pH為6～9，4℃緩慢攪拌1～10小時，透析1～5天即得。?

進一步本發明提供苯乙醇胺A的抗體，其為上述的抗原作為免疫原免疫動物制得。可以按照常規方法制得多克隆抗體或單克隆抗體。?

基于上述抗原和抗體，本發明提供苯乙醇胺A檢測試劑盒，其包含上述的抗原和/或上述的抗體。?

具體地，本發明試劑盒包括：包被上述抗原的酶標板，上述的抗體；以及選自以下試劑的一種或多種：?

A）??酶標二抗；?

B）??底物液；?

C）??終止液；?

D）??標準品溶液；?

E）??封閉液；?

F）??洗滌液。?

所述抗原為所述的半抗原與牛血清白蛋白或卵清白蛋白的偶聯復合物；所述抗體為所述的半抗原與牛血清白蛋白或卵清白蛋白的偶聯復合物為免疫原制得的多克隆抗體；所述酶標二抗為辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG；所述底物液為TMB溶液；所述終止液為H₂SO₄溶液；所述標準品溶液為苯乙醇胺A溶液；所述封閉液為酪蛋白溶液；所述洗滌液為PBST緩沖液。?

上述檢測試劑盒可以用于檢測苯乙醇胺A，尤其是食品和飼料中苯乙醇胺A的檢測。?