[發明專利]一種同時檢測兩種環境雌激素的傳感器的制備方法及應用

無效

• 申請號: 201310136866.0
• 申請日: 2013-04-19
• 公開（公告）號: CN103235144A
• 公開（公告）日: 2013-08-07
• 發明（設計）人: 魏琴;杜斌;于海琴;吳丹;張勇;毛珂霞;李賀;馬洪敏
• 申請（專利權）人: 濟南大學
• 主分類號: G01N33/74
• 分類號: G01N33/74;G01N27/48
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種同時檢測兩種環境雌激素的傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）氨基化SBA-15的合成

將1?g?三嵌段共聚物EO20PO70EO20（P123）溶解在30?mL、1.5~2?mol?L^-1的?HCl溶液中，加入2.215?g正硅酸乙酯（TEOS），混合物在34℃下攪拌4~5?h，轉移到高壓釜在100℃條件下加熱20~22?h，冷卻后過濾，將獲得的白色粉末在空氣中干燥，然后在560℃條件下煅燒3~4?h除去模板，合成制得SBA-15；將所合成的SBA-15，加10~15mL無水乙醇，置于100?mL三口燒瓶中，油浴，加熱到70℃后，迅速加入50?μL?3-氨丙基三乙氧基硅烷，70℃恒溫回流3h，離心，用無水乙醇洗滌沉淀3次，室溫下真空干燥9~11?h，得到氨基功能化的SBA-15；

（2）Pt雜化的SBA-15的合成

將氨基功能化的SBA-15與HPtCl₄以質量比1?:?0.5~?1混合并用水稀釋成溶液，將混合物在室溫下攪拌18~24?h，離心后用水重新稀釋，用稀HCl調節溶液的pH?<2，攪拌20~25?min，得到混合液；將40~50?mmol?L^-1的NaBH₄溶液逐滴加入到所述的混合液中，直到所有的HPtCl₄全部還原成金屬Pt，將混合液離心、真空干燥，制得Pt雜化的SBA-15（PtSBA-15）；

（3）石墨烯（GS）溶液制備

將2.0?mg?GS溶解于1mL高純水中，超聲0.5~2?h，制成濃度為2mg?mL^-1?GS溶液；

（4）PtSBA-15/二抗溶液的制備

取1~2?mg?PtSBA-15分散在1?mL的pH?7.4的PBS緩沖溶液中，加入0.5~1.5?mL?、質量分數為2.5%的戊二醛溶液，攪拌2~4?h；加入1~2?mL兩種環境雌激素二抗（Ab₂）中的一種，將上述混合物在室溫下攪拌10~12?h，離心，制得兩種PtSBA-15/Ab₂溶液，置于4^?C下儲存，備用；

（5）雙通道免疫傳感器的構建

1）取一片雙通道絲網印刷電極，超純水沖洗；分別取4~6?μL、2mg?mL^-1?GS溶液，滴涂到雙通道絲網印刷電極的2個工作電極表面上，室溫晾干；

?2）在1）中得到的2個工作電極的表面上分別滴加6~8μL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺（EDC/NHS）混合溶液，保持濕潤、孵化1~2?h，超純水清洗，晾干；所述EDC和NHS的濃度分別為1~4?mg/mL和1mg/mL；

3）分別取4~8?μL兩種環境雌激素一抗（Ab₁），分別滴涂于2）得到的對應的兩個工作電極表面上，4?^oC條件下晾干；

4）分別取4~6?μL、質量分數為0.5~1?%的BSA溶液，滴涂于3）得到兩個工作電極表面上，保持電極濕潤3~4?h，?4?^oC下晾干，超純水清洗、晾干，制得一種同時檢測兩種環境雌激素的傳感器。

2.如權利要求1所述的一種同時檢測兩種環境雌激素的傳感器的制備方法，所述的環境雌激素選自己烯雌酚和雌二醇。

3.如權利要求1所述的一種同時檢測兩種環境雌激素的傳感器的制備方法，（4）中所述兩種環境雌激素二抗的濃度為400~500μg/mL。

4.如權利要求1所述的一種同時檢測兩種環境雌激素的傳感器的制備方法，（5）中所述兩種環境雌激素一抗的濃度為5~10μg/mL。

5.如權利要求1所述的制備的一種同時檢測兩種環境雌激素的傳感器，用于兩種環境雌激素己烯雌酚和雌二醇的同時檢測，步驟如下：

（1）將制得的免疫傳感器溫育在一系列濃度不同的己烯雌酚和雌二醇對應的抗原溶液中，放置1?h，4?^oC下晾干，清洗電極；

（2）滴涂6?μL、?PtSBA-15/Ab₂溶液到（1）得到的電極表面上，晾干、清洗，制得組裝的工作電極，置于4?^?C冰箱中備用；

（3）將參比電極、對電極和組裝的工作電極連接在電化學工作站上，在電解槽中加入40~60?μL、5~10?mmol/L?H₂O₂的pH=7.0~7.8的PBS緩沖溶液，用循環伏安和方波伏安法檢測傳感器的電流響應，根據所得電流響應與兩種環境雌激素己烯雌酚和雌二醇的標準溶液濃度之間的關系，繪制工作曲線；

（4）將待測樣品代替兩種環境雌激素己烯雌酚和雌二醇的標準溶液，按照所述己烯雌酚和雌二醇工作曲線的繪制方法進行檢測。