[發(fā)明專利]一種以愈傷組織為外植體的雜交楊農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310135903.6
• 申請(qǐng)日: 2013-04-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103194486A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-07-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王潔華;昝艷君;籍燕;魏志蓉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 陸藝

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

楊屬Populus?L.在全世界約有100多種，廣泛分布于歐亞和北美洲。我國(guó)約有62種，是世界楊樹(shù)種質(zhì)資源最多的國(guó)家。楊屬植物因其生長(zhǎng)快、適應(yīng)性強(qiáng)、用途廣泛，不僅在水土保持和維護(hù)生態(tài)平衡方面發(fā)揮重要作用，而且還具有廣泛的工業(yè)用途，是制漿造紙、膠合板、包裝材料等的重要原料。

長(zhǎng)期以來(lái)，楊樹(shù)的改良主要通過(guò)雜交育種的方式進(jìn)行，但因其生長(zhǎng)發(fā)育受光照、水分、溫度很多因素影響，與其它農(nóng)作物和園藝植物比較，有許多特有的生物學(xué)特性，如較長(zhǎng)的生長(zhǎng)周期、復(fù)雜的生殖方式、高度雜合性等，使得傳統(tǒng)的楊樹(shù)育種方法己遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代育種的要求，所以，利用組織培養(yǎng)技術(shù)和基因工程方法來(lái)滿足實(shí)踐中對(duì)楊樹(shù)育種的要求具有重要的意義。

進(jìn)入二十世紀(jì)八十年代后，隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)的快速發(fā)展，以1983年首株轉(zhuǎn)基因煙草問(wèn)世為標(biāo)志，功能基因的克隆和轉(zhuǎn)基因技術(shù)己廣泛應(yīng)用到植物抗性的研究領(lǐng)域。盡管以木本植物為實(shí)驗(yàn)材料的林木基因工程因研究難度較大，進(jìn)展相對(duì)滯后，但是由于楊樹(shù)生長(zhǎng)速度快，易繁殖，核基因組(約420Mb)及染色體數(shù)目相對(duì)較小，易于通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，使得楊樹(shù)成為研究樹(shù)木分子生物學(xué)、林業(yè)生物技術(shù)及樹(shù)木基因組的模式植物。

目前，在植物上應(yīng)用的遺傳轉(zhuǎn)化方法主要有DNA直接轉(zhuǎn)移法和根癌農(nóng)桿菌（Agrobactenium?tumefaciens）介導(dǎo)法。其中后者最為常用，是目前應(yīng)用最廣泛且結(jié)果較為理想、技術(shù)較為成熟的一種基因轉(zhuǎn)化方法。它具有操作簡(jiǎn)便，外源基因插入一般為單拷貝或低拷貝，整合位點(diǎn)穩(wěn)定，轉(zhuǎn)移DNA片段明確，整合后外源基因結(jié)構(gòu)變異小，可轉(zhuǎn)移大片段DNA，可直接用不同的植物組織進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移等優(yōu)點(diǎn)。已被應(yīng)用于雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化研究，現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因植物如煙草擬南芥西紅柿玉米等，80%以上是通過(guò)這種方法獲得的。

隨著對(duì)楊屬的遺傳轉(zhuǎn)化研究的逐漸深入，農(nóng)桿菌侵染已經(jīng)應(yīng)用于胡楊、歐洲黑楊、毛果楊、小葉楊等樹(shù)種，但對(duì)白楊派及其雜種無(wú)性系的研究較為滯后，轉(zhuǎn)化效率較低；而白楊派樹(shù)種具有適應(yīng)生境廣、抗逆性強(qiáng)、鄉(xiāng)土樹(shù)種多、種間雜交能力強(qiáng)、能在大陸半干旱帶和大陸濕潤(rùn)帶等廣泛生境范圍內(nèi)栽培并可發(fā)揮較大的生產(chǎn)作用等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，因此研究一種針對(duì)白楊派的高效轉(zhuǎn)基因方法對(duì)林木分子育種意義深遠(yuǎn)。目前白楊派中農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因的方法多局限于葉片和葉柄，而直接侵染這些外植體周期長(zhǎng)轉(zhuǎn)化效率低，而且后期染菌嚴(yán)重，因此本研究以白楊雜種無(wú)性系717-1B4（P.tremula×P.alba）為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，建立了一種以愈傷組織為受體的雜交楊農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法。

注：本研究采用的農(nóng)桿菌為C58/pMP90/pH7GWIWG2(I)，C58具有利福平抗性，輔助Ti質(zhì)粒pMP90具有慶大霉素抗性；通過(guò)Gateway技術(shù)構(gòu)建的表達(dá)載體pH7GWIWG2(I)具有壯觀霉素抗性，其T-DNA上的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因作為轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)的選擇標(biāo)記基因，編碼蛋白具有潮霉素抗性。具有潮霉素抗性的再生苗用特異性引物進(jìn)行全基因組PCR檢測(cè)，產(chǎn)物大小為456bp，驗(yàn)證目的片段轉(zhuǎn)入白楊雜種無(wú)性系717-1B4（P.tremula×P.alba）中。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種以愈傷組織為外植體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化白楊雜種無(wú)性系方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

一種以愈傷組織為外植體的雜交楊農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法，包括下述步驟：

（1）愈傷誘導(dǎo)：

將白楊雜種無(wú)性系717-1B4（P.tremula×P.alba）的腋芽或頂芽置于基本培養(yǎng)基上繼代繁殖，培養(yǎng)4-6周獲得組培苗；切取所述組培苗0.8-1.5cm不帶腋芽的莖段，用刀片沿著莖段縱軸方向劃2-3次造成傷口或切取所述組培苗的帶有0.1-0.5cm²葉片的葉柄置于M1'固體培養(yǎng)基中，于24-26℃黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)12-15天；更換一次M1'固體培養(yǎng)基，繼續(xù)在24-26℃黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)12-15天，有愈傷組織生成；

（2）愈傷組織預(yù)培養(yǎng)：

將步驟（1）獲得的愈傷組織切成0.4-0.6cm³的塊，置于M1固體培養(yǎng)基預(yù)配養(yǎng)2-3天；

（3）菌種活化與培養(yǎng)：

用移液槍槍頭挑取-80℃保存的農(nóng)桿菌至含有抗生素的YEB固體培養(yǎng)基上，27-29℃倒置暗培養(yǎng)20-28h；挑取培養(yǎng)后的農(nóng)桿菌在另一含有抗生素的YEB固體培養(yǎng)基上劃線，27-29℃倒置暗培養(yǎng)36-48h；