[發明專利]一種以愈傷組織為外植體的雜交楊農桿菌轉化方法

無效

• 申請號: 201310135903.6
• 申請日: 2013-04-18
• 公開（公告）號: CN103194486A
• 公開（公告）日: 2013-07-10
• 發明（設計）人: 王潔華;昝艷君;籍燕;魏志蓉
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

1.一種以愈傷組織為外植體的雜交楊農桿菌轉化方法，其特征包括下述步驟：?

（1）愈傷誘導：?

將717楊樹的腋芽或頂芽置于基本培養基上繼代繁殖，培養4-6周獲得組培苗；切取所述組培苗0.8-1.5cm不帶腋芽的莖段，用刀片沿著莖段縱軸方向劃2-3次造成傷口或切取所述組培苗的帶有0.1-0.5cm²葉片的葉柄置于M1'固體培養基中，于24-26℃黑暗條件下預培養12-15天；更換一次M1'固體培養基，繼續在24-26℃黑暗條件下預培養12-15天，有愈傷組織生成；?

（2）愈傷組織預培養：?

將步驟（1）獲得的愈傷組織切成0.4-0.6cm³的塊，置于M1固體培養基預配養2-3天；?

（3）菌種活化與培養：?

用移液槍槍頭挑取-80℃保存的農桿菌至含有抗生素的YEB固體培養基上，27-29℃倒置暗培養20-28h；挑取培養后的農桿菌在另一含有抗生素的YEB固體培養基上劃線，27-29℃倒置暗培養36-48h；?

挑取單菌落至2-4mL含有抗生素的YEB液體培養基的無菌試管中，150-200rpm27-29℃暗培養12-16h；吸取0.1-1.0mL菌液放置于50-75mL含有抗生素的YEB液體培養基的錐形瓶中，150-200rpm27-29℃暗培養至菌液OD₆₀₀=0.6-0.8；?

（4）侵染：?

將步驟（3）獲得的菌液在室溫、3500-4000rpm離心10-15min，棄去上清液，將沉淀用50-75mL?M液重懸，得到侵染液，按30-50個/25mL的比例將經步驟（2）預培養的愈傷組織放入所述侵染液中，24-26℃條件下80-100rpm侵染10-20min；?

（5）共培養：?

取出侵染后的愈傷組織，吸干表面殘留的侵染液，放在M1固體培養基上，24-26℃，暗條件下培養24-36小時；?

（6）延遲選擇：?

取出步驟（5）培養的愈傷組織，棄掉因侵染而褐變的愈傷組織，先用去離子水在180-220rpm下洗滌4-5min，洗滌2-3次，再用濃度為350-500mg/L的頭孢霉素-去離子水溶液150-200rpm洗滌4-5min，洗滌2-3次，吸干表面水分并轉移至CIM固體選擇培養基中，24-26℃于黑暗條件下培養3-5天，舍棄與CIM固體選擇培養基的接觸處可見白色農桿菌菌落的愈傷組織，將剩余愈傷組織轉移到新鮮的CIM固體選擇培養基中，500-800Lux弱光下培養5-8天；?

（7）誘導不定芽：?

將步驟（6）獲得的愈傷組織轉移至SIMa固體培養基中，22-26℃1500-2000Lux，光照周期為光照/黑暗16h/8h的條件下進行培養，得到表面為白色或白色略帶褐化的愈傷組織，每?14-21天更換一次SIMa固體培養基；待白色或白色略帶褐化的愈傷組織表面出現綠色的愈傷組織，用解剖刀剝離綠色的愈傷組織轉移至新鮮SIMa固體培養基中22-26℃1500-2000Lux光照條件下培養，待綠色愈傷組織表面開始長出玻璃化的不定芽；將帶有玻璃化不定芽的綠色愈傷組織轉移到含有SIMb固體培養基的組培瓶中，直到不定芽生長至1-2cm；?

（8）伸長培養：?

切取不定芽轉移至含有SEM固體培養基的組培瓶中24-26℃1500-2000Lux光照條件下培養2-4周，獲得表型趨于正常的芽；?

（9）誘導生根及檢測：?

取步驟（8）獲得的芽，切去底部膨大部位，轉入RM固體培養基中，24-26℃1500-2000Lux光照下誘導生根，從已生根的再生楊樹上剪取葉片提取基因組DNA，并進行全基因組PCR檢測，驗證農桿菌基因轉化了的雜交楊樹。?

2.根據權利要求1所述的一種以愈傷組織為外植體的雜交楊農桿菌轉化方法，其特征是步驟（1）所述基本培養基的組成為：MS鹽2.2g，蔗糖20-30g，瓊脂7-7.2g，定容至1L，pH5.6-5.8；所述M1'固體培養基的組成為：MS鹽4.4g，蔗糖20-30g，生長素NAA1.86mg，細胞分裂素2ip1.02mg，瓊脂7-7.2g，定容至1L，pH=5.6-5.8。?