[發明專利]一種蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白Bt Cry35Ba2的制備方法

無效

• 申請號: 201310133824.1
• 申請日: 2013-04-17
• 公開（公告）號: CN103233021A
• 公開（公告）日: 2013-08-07
• 發明（設計）人: 王保民;曹振;譚桂玉;張亮;張威;郭素琴;張瑞;何麗珊
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N15/32
• 分類號: C12N15/32;C12N15/62;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/15;C12N1/21;C12N1/19;C12N15/70;C07K14/325;C07K19/00;A01N57/16;A01N63/02;A61P7/04
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，涉及一種蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白的制備方法，特別涉及一種蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白Bt?Cry35Ba2的制備方法。

背景技術

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus?thuringiensis，簡稱Bt）是一種廣泛分布于土壤中的革蘭氏陽性菌，在其芽孢的形成過程中，會形成具有殺蟲活性的晶體蛋白（Cry蛋白）。該蛋白對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目等多種害蟲具有較高的毒性，是應用最為廣泛的毒蛋白。由于此特性，編碼Cry蛋白的基因被生物學者認作是轉基因作物的熱門備選基因，并已有多個轉基因作物品種轉入該基因并商品化，在全球范圍內廣泛種植。Bt菌系含有大量不同的殺蟲晶體蛋白編碼基因，至今已有近180個不同的Bt殺蟲晶體蛋白基因被克隆和測序，Bt?Cry35Ba2就是其中一種，主要針對危害玉米等作物根部的鞘翅目幼蟲具有毒性。

轉基因作物的種植滿足了人類對糧食產量、經濟效益需求。同時，也存在著環境安全風險，外源基因導入的隨機性和不確定性，基因表達對作物的生理生化作用的改變，對生態環境構成的威脅等等都難以預測。人們對轉基因作物的安全性存在擔憂，而消除這一擔憂的有效途徑就是對轉基因作物所表達的外源蛋白進行安全性評價。因此，獲取各種Bt殺蟲晶體蛋白基因所表達的外源蛋白，對進行安全性評價意義重大，為后續的檢驗方法建立、檢測標準的實施提供基礎，從而可以有效防止安全隱患的發生，避免轉基因作物對生態環境的破壞，充分發揮轉基因技術在農業生產上的巨大應用潛力。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種經過密碼子優化的蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白Bt?Cry35Ba2的基因。

所述經過密碼子優化的蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白Bt?Cry35Ba2的基因，是在不改變蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白Bt?Cry35Ba2氨基酸序列（GenBank：AY536894.1的第1-387位氨基酸）的前提下，將其野生型編碼基因（GenBank：AY536894.1的第1-1161位）的密碼子替換為大腸桿菌偏好（高頻使用）的密碼子后所得的基因。將優化后的基因命名為N-Cry35Ba2，具體可為如下a）-c）中任一DNA分子：

a）序列表中序列1的第109-1269位核苷酸所示的DNA分子；

b）序列表中序列1所示的DNA分子；

c）與a）或b）所限定的DNA分子至少具有98%的同一性，且編碼序列2或序列2的第37-423位氨基酸所示蛋白質的DNA分子。

其中，序列1共由1296個核苷酸組成，其中第109-1269位核苷酸為將GenBank：AY536894.1的第1-1161位的密碼子替換為大腸桿菌偏好密碼子后所得的基因序列。序列1編碼序列表中序列2所示的蛋白質，其中序列1的第109-1269位核苷酸編碼序列2的第37-423位氨基酸。序列2共由431個氨基酸組成。

含有所述DNA分子（N-Cry35Ba2基因）的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也屬于本發明的保護范圍。

所述重組載體可為重組表達載體，也可為重組克隆載體。

所述重組表達載體可用現有的表達載體構建。所述表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端。使用所述基因構建重組表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型、組成型、組織特異型或誘導型啟動子，它們可單獨使用或與其它的啟動子結合使用；此外，使用本發明的基因構建重組表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子。為了便于對轉基因細胞進行鑒定及篩選，可對所用表達載體進行加工，如加入可發光化合物的基因（GFP基因、螢光素酶基因等）、具有抗性的抗生素標記物（慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等）等。

在本發明中，所述重組表達載體中啟動所述DNA分子（N-Cry35Ba2基因）轉錄的啟動子具體為T7啟動子。

所述重組表達載體具體為將所述DNA分子（N-Cry35Ba2基因）插入到質粒pET28a的多克隆位點處得到的重組質粒。在本發明的一個實施例中，所述多克隆位點為EcoRⅠ和Xho?I。更加具體的，所述重組表達載體的（pET28a-35Ba2）的核苷酸序列如序列表中序列3所示。

其中，序列3共由6502個核苷酸組成，第137-1432位核苷酸為序列1的反向互補序列。