[發明專利]多倍體積雪草品種及其培育方法

有效

• 申請號: 201310133181.0
• 申請日: 2013-04-17
• 公開（公告）號: CN103270948A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發明（設計）人: 蘇鈺琴;蔣臻韜;黃忠藝
• 申請（專利權）人: 桂林百科農業科技有限公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;A01H1/02
• 代理公司: 北京中海智圣知識產權代理有限公司 11282
• 代理人: 朱永飛

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種四倍體﹑三倍體積雪草品種及其培育方法。

背景技術

傘形科植物積雪草Centela?asiatica(L．)Urban別名雷公根、崩大碗等，為二倍體植株，主產于廣西、貴州、云南、廣東等地，為歷年版《中國藥典》所收載的常用中藥，全草入藥。其味苦、辛，性涼，具有清熱利濕、解毒消腫的功效。是生產三金片、玉葉解毒糖漿等中成藥的核心原料，中醫臨床用于治療濕熱黃疸，中暑腹瀉，石淋血淋，癰腫瘡毒，跌撲損傷等疾病。民間常作為涼茶、蔬菜食用。近年來，諸多企業用于提取積雪草甙、積雪草酸等，市場需求不斷增加。長期以來，積雪草品種培育、種苗繁育、人工種植仍處于空白，目前僅依靠野生資源。但野生積雪草分布零散，植株小、產量低、大量采收難度大。即使開展人工種植，其投入大于產出，無人問津，導致積雪草原料供應緊張。

通過倍數性育種手段使藥用植物基因組多倍化，可以獲得株型大、有效成分含量高的品種、大幅提高藥用植物的產量與品質，使人工種植成為現實。而且，三倍體藥用植物在遺傳空間上與其他品種形成生殖隔離，無后代分離，是永久雜種，可以固定雜種優勢。

發明內容

為提高積雪草的產量和品質，本發明提供了多倍體積雪草品種及其培育方法。本發明是用氨磺靈作為誘導劑，通過液體法或固體法進行人工誘導，成功獲得一種積雪草同源四倍體品種，然后可以與常規二倍體野生種雜交篩選培育出三倍體積雪草品種。

本發明提供的多倍體積雪草品種培育方包括以下步驟：

1）從二倍體積雪草種質資源中篩選出優良積雪草植株；

2）選取優良積雪草成年植株的頂芽，經預處理后按常規分化培養基誘導產生不定芽和愈傷組織，然后轉接到常規增殖培養基進行繼代培養；

3）將步驟2）中生長勢強的組培繼代苗或是分生能力強的愈傷組織暗培養5天后，以氨磺靈為誘變劑，采用液體或固體混培法，誘變積雪草組培繼代苗或愈傷組織產生染色體基因組倍數性變化，轉入常規分化培養基中進行光照培養，獲得叢生芽，分株后轉入生根培養基中培養成根莖葉完整的組培苗；

4）將步驟3）獲得的根莖葉完整的組培苗與二倍體組培苗對照，將葉片大小、顏色有明顯變化的植株選為基因組可能加倍的候選植株；

5）剪取步驟4）中的候選植株的分生組織，進行染色體倍性鑒定，選取染色體數目2n=4x=36的幼苗，將其煉苗、種植成活，即獲得四倍體積雪草品種。

還可以繼續包括以下步驟：

6）將四倍體積雪草和二倍體積雪草人工授粉雜交，得到雜交積雪草種子；

7）將雜交種子繁育成完整植株種植，再對其分生組織進行染色體數目檢測，篩選獲得三倍體積雪草品種。

下面列舉以上主要步驟的優選操作方法：

步驟1）中，作為原始親本的優良積雪草植株是指：從染色體核型指數為2n=18的野生積雪草中選擇具有莖段節間長、莖粗、葉片大且厚實、有效成分含量高的成年植株。

步驟3）所述誘變方法是：固體混培法是指在無菌條件下將生長勢強的組培繼代苗或是分生能力強的愈傷組織暗培養5-7天，然后轉接到添加有10-12μmol.L-1氨磺靈溶液MS固體培養基中在5-10℃低溫下暗培養2-5d，再轉入不含氨磺靈溶液常規分化培養基中進行光照培養；液體法是指在無菌條件下先用保水性好的材料覆蓋住繼代苗頂芽或愈傷組織，然后滴入過濾滅菌的8-10μmol.L-1氨磺靈溶液將棉花完全浸濕后在5-10℃低溫下暗培養10-12小時，無菌水洗凈，轉入不含氨磺靈溶液的常規分化培養基中光照培養；?

步驟3）所述的光照培養是每天光照10小時，光照強度為1000-2000lx，培養溫度為25℃；

步驟3）所述的生根培養是：培養基為1/2MS+NAA0.3mg/L+IAA0.3mg/L，培養條件為暗培養7d后進行光照培養，光照強度為1000-2000lx，培養時間為10h∕d，培養溫度是25℃。

步驟5）所述的染色體倍性鑒定方法是：剪取目標株幼嫩根尖0.5cm，清水浸泡，經過無水乙醇：冰乙酸=3：1的卡諾固定液固定15min以上，清水沖洗15min,?濃鹽酸：甲醇=1：1的解離液解離2-30min，清水沖洗15min，切取根尖0.1mm，用卡寶品紅染色液染色，壓片觀察統計根尖染色體。

步驟6）所述的三倍體雜交積雪草種子為：♀4N×♂2N或♂4N×♀2N→F1為3x。

本發明提供的多倍體積雪草品種即為上述方法培育而得的四倍體積雪草品種或者三倍體積雪草品種。

本發明的優點：