[發明專利]一種染色體重組增效蛋白基因蘇云金桿菌工程菌及其構建方法

無效

• 申請號: 201310132986.3
• 申請日: 2013-04-17
• 公開（公告）號: CN103205392A
• 公開（公告）日: 2013-07-17
• 發明（設計）人: 徐健;韓光杰;趙松;劉琴;李傳明;馬談斌
• 申請（專利權）人: 江蘇里下河地區農業科學研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/34;C12N15/63;C12R1/07
• 代理公司: 揚州蘇中專利事務所(普通合伙) 32222
• 代理人: 孫忠明

技術領域

本發明涉及一種染色體重組增效蛋白基因（Enhancin）蘇云金桿菌工程菌的構建方法，尤其是一種以轉屬主粘蟲顆粒體病毒（PuGV-Ps）增效蛋白基因為目的基因、蘇云金桿菌（Bt）為受體菌，通過含轉座子的衍生載體pLTV-1將PuGV-Ps增效蛋白基因整合到蘇云金桿菌染色體上，并經過高溫轉接消除轉座單元外的抗性標記基因，從而構建穩定表達增效蛋白基因、無抗性標記基因的增效Bt工程菌的方法。

背景技術

長期以來，農業病蟲害的危害主要依賴化學農藥防治。我國農田化學農藥有效含量年用量超過250000噸，致使農產品農藥殘留增加、害蟲危害加重、生態環境破壞。推廣應用生物農藥，不僅可以降低農藥殘留、提高農產品品質，而且更是保護環境、促進農業可持續發展的有效途徑。蘇云金桿菌（Bacillus?thuringiensis，Bt）是研究、應用范圍最廣的生物殺蟲劑，其主要作用成分為具體代謝產生的殺蟲晶體蛋白（Insecticidal?Crystal?Proteins，ICPs）或δ-內毒素（delta-endotoxin）。ICPs對多種重要的農林業害蟲具毒殺作用，Bt已作為有效的微生物農藥廣泛應用于害蟲的生物防治。然而受本身生物學特性的限制，在實際使用中存在毒力不強、殺蟲譜窄、殺蟲速度慢等影響大面積推廣應用的問題，同時害蟲對蘇云金桿菌抗藥性的產生和發展也越來越受到人們的關注，因此構建廣譜、高效Bt殺蟲工程菌成為蘇云金桿菌殺蟲劑研究與開發的新方向。

增效蛋白（Enhancin）最早是在粘蟲顆粒體病毒（Pseudaletiaunipuncta?granulovirus，PuGV）包涵體中發現的能提高核型多角體病毒侵染能力的生物增效因子，目前已在PuGV、粉紋夜蛾顆粒體病毒（Trichoplusia?ni?GV，TnGV）、棉鈴蟲顆粒體病毒（Helicoverpa?armigera,?HaGV）等8種顆粒體病毒、4種痘病毒、2種多角體病毒中發現這類增效作用的蛋白存在。增效蛋白對Bt毒力同樣具有顯著增強作用。將TnGV包涵體中純化的增效蛋白加入Bt后飼喂試蟲，測試的6種不同鱗翅目幼蟲的死亡率提高了2-10倍；4種不同的Bt商品制劑中加入TnGV增效蛋白對粉紋夜蛾的防效提高了3-6倍。江蘇里下河地區農科所自2000年開展轉屬主顆粒體病毒PuGV-Ps對Bt增強作用研究，證明PuGV-Ps中含有提高Bt毒力的增效蛋白，微量PuGV-Ps對Bt增效作用顯著，同時可提高Bt對害蟲的作用速度。顆粒體病毒增效蛋白的殺蟲增效活性，在桿狀病毒、蘇云金桿菌等微生物農藥的研究應用上具有廣闊的前景。

目前構建Bt工程菌的主要途徑是通過增加ICPs基因拷貝數、消除冗余質粒、輔助蛋白利用等手段提高ICPs基因的表達量。這種改造雖提高了Bt工程菌的殺蟲活性，但某種意義上講是通過提高ICPs使用濃度而提高防效，同樣也存在由于增加ICPs選擇壓力帶來的害蟲抗藥性風險。

發明內容

本發明的目的是提供一種染色體重組增效蛋白基因蘇云金桿菌工程菌及其構建方法，本發明利用增效蛋白基因構建增效基因，在ICPs正常使用濃度下，通過增效蛋白的協同增效作用提高Bt毒蛋白的活性，從而增強防效，產品毒力強、殺蟲譜寬、殺蟲速度快，不僅可以降低農藥殘留、提高農產品品質，而且更是保護環境、促進農業可持續發展的有效途徑。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的，一種染色體重組增效蛋白基因蘇云金桿菌工程菌，所述工程菌是以轉屬主粘蟲顆粒體病毒（PuGV-Ps）增效蛋白基因為目的基因、蘇云金桿菌(Bt)為受體菌，通過含轉座子的衍生載體pLTV-1將PuGV-Ps增效蛋白基因整合到蘇云金桿菌染色體上，并經過高溫轉接消除轉座單元外的抗性標記基因獲得。

上述染色體重組增效蛋白基因蘇云金桿菌工程菌的構建方法：

（1）PuGV-Ps增效蛋白基因的克隆：室內人工飼養東方粘蟲，以PuGV感染寄主，分離純化獲得PuGV-Ps，提取顆粒體病毒DNA，PCR擴增增強蛋白全長基因En；擴增基因En與克隆載體pET-15b經酶切連接并轉化大腸桿菌DH5α，氨芐青霉素LB平板篩選克隆子，酶切鑒定重組增效蛋白基因質粒pET-15b-En；