[發明專利]一種染色體重組增效蛋白基因蘇云金桿菌工程菌及其構建方法

無效

• 申請號: 201310132986.3
• 申請日: 2013-04-17
• 公開（公告）號: CN103205392A
• 公開（公告）日: 2013-07-17
• 發明（設計）人: 徐健;韓光杰;趙松;劉琴;李傳明;馬談斌
• 申請（專利權）人: 江蘇里下河地區農業科學研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/34;C12N15/63;C12R1/07
• 代理公司: 揚州蘇中專利事務所(普通合伙) 32222
• 代理人: 孫忠明

1.一種染色體重組增效蛋白基因蘇云金桿菌工程菌，其特征是，所述工程菌是以轉屬主粘蟲顆粒體病毒PuGV-Ps增效蛋白基因為目的基因、蘇云金桿菌Bt為受體菌，通過含轉座子的衍生載體pLTV1將PuGV-Ps增效蛋白基因整合到蘇云金桿菌染色體上，并經過高溫轉接消除轉座單元外的抗性標記基因獲得。

2.權利要求1所述的染色體重組增效蛋白基因蘇云金桿菌工程菌的構建方法，其特征是：

（1）PuGV-Ps增效蛋白基因的克隆：室內人工飼養東方粘蟲，以PuGV感染寄主，分離純化獲得PuGV-Ps，提取顆粒體病毒DNA，PCR擴增增強蛋白全長基因En；擴增基因En與克隆載體pET-15b經酶切連接并轉化大腸桿菌DH5α，氨芐青霉素LB平板篩選克隆子，酶切鑒定重組增效蛋白基因質粒pET-15b-En；

（2）增效蛋白整合載體的構建：以重組增效蛋白基因質粒pET-15b-En為模板，擴增增效蛋白基因；以含有轉座子Tn917的衍生質粒pLTV1為載體，Saml酶切線性化連接擴增的增效蛋白基因后轉化大腸桿菌感受態細胞Top10，氨芐青霉素LB平板篩選陽性克隆子Top10-3，Xhol和Nhel雙酶切鑒定增效蛋白基因的插入位點和方向，獲得增效蛋白基因整合載體pLTV1-En；

（3）蘇云金桿菌感受態細胞的制備及整合載體的轉化：LB液體培養基接種蘇云金桿菌活化，以LB+0.5M山梨醇為培養基轉接培養制備蘇云金桿菌感受態細胞；Top10-3菌中提取增效蛋白基因整合載體pLTV1-En，電擊法將整合載體pLTV1-En轉化至蘇云金桿菌感受態細胞，氨芐青霉素LB平板篩選陽性克隆子，獲得轉化子Bt-En-1；

（4）轉化子的高溫轉接和篩選：將轉化子Bt-En-1接種于LB培養液中，40-50℃培養并轉接5-7次后涂氨芐青霉素LB平板產生單菌落，分別點種在氨芐青霉素單抗平板和無抗平板的對應位置，置28-30℃培養48h后，挑選無抗培養基中失去抗性的單菌落，顯微鏡鏡檢是否產生伴胞晶體蛋白，再通過提取質粒和PCR擴增，最后得到染色體重組增效蛋白蘇云金桿菌工程菌Bt-En。

3.根據權利要求2所述的染色體重組增效蛋白基因蘇云金桿菌工程菌的構建方法，其特征是，步驟（1）中所述提取顆粒體病毒DNA，PCR擴增增強蛋白全長基因En的方法為：堿裂解酚抽提法提取?PuGV-Ps?DNA用作模板,?設計上游引物：5’-?GC?CAT?ATG?TCG?TAC?AAA?GTG?ATT?GTA?CCC?GC?T-3’?，下游引物：5’-?GC?CTC?GAG?TGA?ACG?TTA?TTA?GAA?CGC?TAT?CAT?T?-3’，引入Nde?I、Xho?Ⅰ兩個酶切位點，PCR擴增PuGV-Ps增效蛋白基因；PCR擴增的反應條件：先94?℃預變性4?min，然后依次94?℃變性30?sec、56?℃復性30?sec、72?℃延伸3?min，30個循環；最后72?℃延伸10?min；瓊脂糖電泳檢測擴增增效蛋白基因片段。

4.根據權利要求2所述的染色體重組增效蛋白基因蘇云金桿菌工程菌的構建方法，其特征是，步驟（2）中所述以重組增效蛋白基因質粒pET-15b-En為模板，擴增增效蛋白基因為：以重組增效蛋白基因質粒pET-15b-En為模板，設計上游引物：5’-AG?AAT?TCG?AGC?TCG?GTA?CCC?GGG?ATG?TCG?TAC?AAA?GTG?ATT?GTA?CCC?GCT-3’；下游引物：GT?CGA?CTC?TAG?AGG?ATC?CCC?GGG?TGA?ACG?TTA?TTA?GAA?CGC?TAT?CATT，上下游引入Smal酶切位點，PCR擴增增效蛋白基因，PCR擴增反應條件：先95?℃預變性5?min，然后依次97?℃變性30?sec、55?℃復性30?sec、72?℃延伸3?min，35個循環；最后72?℃延伸10?min；瓊脂糖電泳檢測擴增增效蛋白基因片段。