[發明專利]一種從水稻種子中分離純化重組人乳鐵蛋白的方法

有效

• 申請號: 201310131488.7
• 申請日: 2013-04-16
• 公開（公告）號: CN104109204B
• 公開（公告）日: 2017-11-07
• 發明（設計）人: 楊代常;施婧妮;歐吉權
• 申請（專利權）人: 武漢禾元生物科技股份有限公司
• 主分類號: C07K14/79
• 分類號: C07K14/79;C07K1/18
• 代理公司: 北京律誠同業知識產權代理有限公司11006
• 代理人: 黃韌敏

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種分離純化重組人乳鐵蛋白的方法。

背景技術

乳鐵蛋白（LF）是一種鐵結合蛋白，廣泛存在于哺乳動物乳汁和其他多種組織及其分泌液中，具有多種生理功能如抗菌、抗炎以及提高免疫力等。許多體外試驗和動物實驗都表明乳鐵蛋白對腸內微生物感染，如輪狀病毒、賈弟蟲、志賀氏菌、沙門氏菌感染，都具有預防作用。乳鐵蛋白對腸道病原菌的抑制作用主要通過兩種途徑來實現：抑制細菌的生長；破壞細菌表面的毒力因子功能從而減弱病毒粘附或者侵入哺乳動物細胞的能力。眾多的研究成果和試驗表明，在嬰幼兒配方食品中添加乳鐵蛋白具有重大意義，既可滿足嬰兒生長發育的需要，同時又對嬰兒的健康起到保護作用。在全球的農業發達國家像新西蘭、瑞士、澳大利亞、荷蘭擁有著全球最優質的奶源，在這些國家的高端嬰幼兒配方奶粉當中，多數有添加乳鐵蛋白這一重要的母乳成分。

受到奶源的限定，乳鐵蛋白的供給遠遠不能滿足市場的需求，有必要為獲得乳鐵蛋白另辟蹊徑。因此，許多研究人員在多種不同的表達系統中進行了乳鐵蛋白的表達，獲得重組乳鐵蛋白。然而依然存在產量低，純化難度大等一系列問題。申請人致力于研究水稻表達系統，成功地在水稻種子中表達了重組人乳鐵蛋白。

發明內容

本發明的目的是提供一種從轉基因水稻種子中分離純化重組人乳鐵蛋白的層析方法，所述層析方法包括以下步驟：

1）從轉基因水稻種子中提取重組人乳鐵蛋白，獲得含重組人乳鐵蛋白的粗提液；

2）將含重組人乳鐵蛋白的粗提液經過陽離子交換層析，進行初級分離純化，獲得含重組人乳鐵蛋白的洗脫液；其中，所述陽離子交換層析介質為弱陽離子交換填料，層析步驟為：

2A)采用5-15倍柱體積的pH為6.0-7.5的10-25mMTris、10-25mMNaAC，0-250mMNaCl緩沖液，以50-200cm/小時的流速平衡層析柱；

2B）以步驟1)的粗提取液作為上樣樣品，其中樣品電導為2-25ms/cm，pH為6.0-7.5；用洗雜緩沖液洗脫雜質，洗雜緩沖液含3-10mMNaH₂PO₄，3-10mMNa₂HPO₄，200-300mMNaCl，pH6.5-8.0，洗脫流速為50-200cm/小時；

2C)用3-10mMNaH₂PO₄，3-10mMNa₂HPO₄，400-650mMNaCl，pH6.5-8.0洗脫緩沖液以50-200cm/小時的流速洗脫樣品，得洗脫液；

3）收集步驟2）所述洗脫液，獲得含重組人乳鐵蛋白的溶液。

優選地，上述步驟2）所述弱陽離子交換樹脂為CMsepharose FF。

本發明所述的層析方法，進一步包括下述層析柱填料再生的步驟：

a)以3-10倍柱體積1-2MNaCl，pH6.5-10.0的高鹽溶液以50-200cm/小時的流速沖洗柱子至UV280無明顯變化；

b)以3-10倍柱體積5-25mM檸檬酸鈉，pH2.0-4.0的緩沖溶液以50-200cm/小時的流速沖洗柱子；

c)以2-5倍柱體積的0.5-1.0MNaOH溶液以30-100cm/小時的流速反沖層析柱；

d)以8-15倍柱體積的超純水沖洗柱子至pH小于10.0，將填料保存在20%的乙醇溶液中。

具體地，本發明所述的層析方法，其中步驟1）所述的提取重組人乳鐵蛋白包括下述步驟：

（1）以重組人乳鐵蛋白轉基因水稻種子為原料，將稻谷脫殼成半精米并研磨成80-100目的米粉；

（2)）將所述米粉與提取緩沖液以重量/體積為1:5-1:10的比例混合，常溫下提取0.5-2小時，獲得混合物；所述提取緩沖液為：10-25mMTris、10-25mMNaAC，0-250mMNaCl，pH6.0-7.5；

（3）將混合物過濾，得到含重組人乳鐵蛋白的粗提液。

本發明所述的層析方法，其中步驟2）中所述層析步驟為：

2a)以10倍柱體積的平衡緩沖液平衡層析柱，平衡緩沖液組成為：25mMTris、20mMNaAC，200mMNaCl，pH6.5，流速為150cm/小時；