[發明專利]一種從水稻種子中分離純化重組人乳鐵蛋白的方法

有效

• 申請號: 201310131488.7
• 申請日: 2013-04-16
• 公開（公告）號: CN104109204B
• 公開（公告）日: 2017-11-07
• 發明（設計）人: 楊代常;施婧妮;歐吉權
• 申請（專利權）人: 武漢禾元生物科技股份有限公司
• 主分類號: C07K14/79
• 分類號: C07K14/79;C07K1/18
• 代理公司: 北京律誠同業知識產權代理有限公司11006
• 代理人: 黃韌敏

1.一種從轉基因水稻種子中分離純化重組人乳鐵蛋白的層析方法，依次包括以下步驟：

1)從轉基因水稻種子中提取重組人乳鐵蛋白，獲得含重組人乳鐵蛋白的粗提液；其中，所述提取包括下述步驟：

(a)以重組人乳鐵蛋白轉基因水稻種子為原料，將稻谷脫殼成半精米并研磨成80-100目的米粉；

(b)將所述米粉與提取緩沖液以重量/體積為1:5-1:10的比例混合，常溫下提取0.5-2小時，獲得混合物；所述提取緩沖液為：10-25mMTris、10-25mMNaAC，0-250mMNaCl，pH6.0-7.5；

(c)將混合物過濾，得到含重組人乳鐵蛋白的粗提液；

2)將由步驟(1)獲得的含重組人乳鐵蛋白的粗提液經過陽離子交換層析，進行初級分離純化，獲得含重組人乳鐵蛋白的洗脫液；其中：

所述陽離子交換層析介質為CMsepharose FF弱陽離子交換填料，層析步驟為：

2A)采用5-15倍柱體積的pH為6.0-7.5的10-25mMTris、10-25mMNaAC，0-250mMNaCl緩沖液，以50-200cm/小時的流速平衡層析柱；

2B)以步驟1)的粗提取液作為上樣樣品，其中樣品電導為2-25ms/cm，pH為6.0-7.5；用洗雜緩沖液洗脫雜質，洗雜緩沖液含3-10mMNaH₂PO₄，3-10mMNa₂HPO₄，200-300mMNaCl，pH6.5-8.0，洗脫流速為50-200cm/小時；

2C)用3-10mMNaH₂PO₄，3-10mMNa₂HPO₄，400-650mMNaCl，pH6.5-8.0洗脫緩沖液以50-200cm/小時的流速洗脫樣品，得洗脫液；

3)收集步驟2)所述洗脫液，獲得含重組人乳鐵蛋白的溶液；

由所述方法獲得的重組人乳鐵蛋白的HPLC純度高于95％；

4)在步驟3)之后將使用后的層析柱填料通過下述步驟再生：

4a)以3-10倍柱體積1-2MNaCl，pH6.5-10.0的高鹽溶液以50-200cm/小時的流速沖洗柱子至UV280無明顯變化；

4b)以3-10倍柱體積5-25mM檸檬酸鈉，pH2.0-4.0的緩沖溶液以50-200cm/小時的流速沖洗柱子；

4c)以2-5倍柱體積的0.5-1.0MNaOH溶液以30-100cm/小時的流速反沖層 析柱；

4d)以8-15倍柱體積的超純水沖洗柱子至pH小于10.0，將填料保存在20％的乙醇溶液中。

2.權利要求1所述的層析方法，其中步驟2)中所述層析步驟為：

2a)以10倍柱體積的平衡緩沖液平衡層析柱，平衡緩沖液組成為：25mMTris、20mMNaAC，200mMNaCl，pH6.5，流速為150cm/小時；

2b)將步驟1)的粗提取液作為上樣樣品，其中樣品電導為22.5ms/cm，pH為6.5，用洗雜緩沖液洗脫雜質，洗雜緩沖液組成為4mMNaH₂PO₄，6mMNa₂HPO₄，300mMNaCl，pH7.5，流速為150cm/小時；

2c)用洗脫緩沖液洗脫樣品，洗脫緩沖液組成為4mMNaH₂PO₄，6mMNa₂HPO₄，600mMNaCl，pH7.5，洗脫流速為150cm/小時，收集含有重組人乳鐵蛋白的洗脫液。

3.權利要求1所述的層析方法，其中提取重組人乳鐵蛋白包括下述步驟：

(1a)以重組人乳鐵蛋白轉基因水稻種子為原料，將稻谷脫殼成半精米并研磨成80-100目的米粉；

(2a)將所述米粉與提取緩沖液以重量/體積為1:10的比例混合，常溫下提取1小時，獲得混合物；所述提取緩沖液為：25mMTris、20mMNaAC，200mMNaCl，pH6.5；

(3a)將混合物過濾，得到含重組人乳鐵蛋白的粗提液。

4.權利要求1所述的層析方法，其中層析柱填料再生步驟包括：

a1)以5倍柱體積2MNaCl，pH7.5的高鹽溶液以150cm/小時的流速沖洗柱子至UV280無明顯變化；

b1)以5倍柱體積20mM檸檬酸鈉，pH3.0的緩沖溶液以150cm/小時的流速沖洗柱子；

c1)以3倍柱體積的0.5MNaOH溶液以50cm/小時的流速反沖層析柱；

d1)以10倍柱體積的超純水沖洗柱子至pH小于10.0，將填料保存在20％的乙醇溶液中。