[發明專利]一種原人參二醇的生物合成方法及其生產菌株

無效

• 申請號: 201310130423.0
• 申請日: 2013-04-15
• 公開（公告）號: CN103173369A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發明（設計）人: 王華明;黃濤;原靜;黃亦鈞
• 申請（專利權）人: 青島蔚藍生物集團有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N15/53;C12N15/60;C12P33/00;C12R1/84
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228
• 代理人: 張瑾

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種原人參二醇的生物合成方法及其生產菌株。

技術背景

原人參二醇（protopanaxadiol,PPD）為二醇型人參皂苷元，主要來源于人參、西洋參等五加科植物。人參皂苷是一種有多種藥理活性的四環三萜類化合物，按化學結構可分為原人參二醇型、原人參三醇型和齊墩果酸型三類。原人參二醇是二醇組人參皂苷的苷元，也是二醇組人參皂苷經微生物酵解后的最終產物，有20(S)和20(R)2種差向異構體，它們均屬于達瑪烷型四環三萜類化合物，其中，20(S)–原人參二醇活性最強。藥理實驗證實，20(S)-原人參二醇有抑制多種癌癥生長、抗抑郁、激活氯離子通道、抑制被激活的鈉通道去極化、抑制人胚腎、HEK-293細胞生長和幽門螺旋桿菌生長等諸多活性。

作為原人參二醇主要來源的人參、西洋參等需要4到15年的生長栽培階段，生產上由于連作障礙和病蟲害的困擾，品質及其生長環境受到嚴重限制；同時具有藥理活性的原人參二醇在人參、西洋參等中的含量稀少。總之，原人參二醇的獲得存在著生長周期長，原材料含量低，提取技術復雜，純度較低等困境。

近年來，植物次生代謝工程發展迅速，應用分子生物學和基因工程方法，在微生物中重建藥用次生代謝產物生物合成途徑已有初步的研究和實踐。三萜皂苷生物合成途徑及其關鍵酶的研究不斷取得進展，為通過次生代謝工程手段生產原人參二醇奠定了基礎。

原人參二醇的生物合成途徑包括三個關鍵步驟，分別為2，3-環氧角鯊烯（2，3-oxidosqualene）的生物合成（由2，3-環氧角鯊烯合成酶（2，3-oxidosqualene?synthase,簡稱SS）催化），達瑪烯二醇（Dammarenediol-II）的生物合成（由達瑪烯二醇合成酶（Dammarenediol-II?synthase，簡稱DS）催化），原人參二醇（protopanaxadiol）的生物合成（由細胞色素P450合成酶（CYP716A47）催化），具體的合成路徑如附圖1所示。

與其他微生物相比,畢赤酵母（Pichia.pastoris）生長快、安全性高,且為模式生物，其代謝調控研究得比較清楚，特別是畢赤酵母自身能夠合成達瑪烯二醇的前體2,3-氧化角鯊烯,從而省去原人參二醇生物合成的第一個關鍵步驟，因此它是一種理想的用于合成原人參二醇的異源表達宿主，對于大規模生產原人參二醇具有重要的意義。

發明內容

本發明的目的是提供一種原人參二醇的生物合成方法，并提供用于生產原人參二醇的重組菌株。

本發明通過將達瑪烯二醇合成酶基因和P450細胞色素合成酶基因進行克隆并在畢赤酵母中共表達，構建了能合成原人參二醇的重組菌株，也為實現原人參二醇的大規模工業化生產奠定了基礎。

一方面，本發明提供了一種生產原人參二醇的重組畢赤酵母工程菌的制備方法，該方法包括下列步驟：

1）構建攜帶有達瑪烯二醇合成酶基因的表達載體；

2）以畢赤酵母為宿主菌株，轉化步驟1）得到的表達載體，獲得重組表達達瑪烯二醇合成酶的畢赤酵母工程菌。

3）構建攜帶有P450細胞色素合成酶基因的表達載體；

4）用步驟3）得到的表達載體轉化步驟2）得到的畢赤酵母工程菌，獲得共表達達瑪烯二醇合成酶和P450細胞色素合成酶的畢赤酵母工程菌。

通過高效液相色譜和MS分析，結果證明，上述共表達達瑪烯二醇合成酶和P450細胞色素合成酶的畢赤酵母工程菌能高效合成原人參二醇，即為本發明所述的生產原人參二醇的畢赤酵母工程菌。

另一方面，本發明提供了一種生產原人參二醇的重組畢赤酵母工程菌，該畢赤酵母工程菌攜帶有含達瑪烯二醇合成酶基因的表達載體和含P450細胞色素合成酶基因的表達載體。

本發明中，所述的達瑪烯二醇合成酶編碼基因具有：

（a）包含SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列；

（b）與SEQ?ID?NO:1具有95%序列同一性的核苷酸序列。

本發明中，所述的P450細胞色素合成酶編碼基因具有：

（a）包含SEQ?ID?NO:2所示的核苷酸序列；

（b）與SEQ?ID?NO:2具有95%序列同一性的核苷酸序列。

本發明的一個優選實施方案中，所述的含達瑪烯二醇合成酶基因的表達載體為質粒pPicZa。

本發明的一個優選實施方案中，所述的含P450細胞色素合成酶基因的表達載體為質粒Ppic9k。