[發明專利]AroI基因及與色氨酸操縱子的串聯表達方法

在審

• 申請號: 201310130368.5
• 申請日: 2013-04-10
• 公開（公告）號: CN104099365A
• 公開（公告）日: 2014-10-15
• 發明（設計）人: 劉俊梅;胡耀輝;李琢偉;王丹;王玉華;樸春紅;于寒松;代偉長
• 申請（專利權）人: 吉林農業大學
• 主分類號: C12N15/77
• 分類號: C12N15/77;C12N15/54;C12N9/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種高新生物技術，尤其涉及一種AroI基因及與色氨酸操縱子的串聯表達方法。

背景技術

在DNA重組技術中，L-色氨酸的合成代謝途徑長，調控復雜，因此其生產調節一直都受到影響。通過基因工程和代謝工程相結合構建高產色氨酸工程菌存在許多困難，需要考慮整個代謝網絡中各個關鍵酶的活性調節。色氨酸操縱子是一個阻遏衰減系統，除了含有5個結構基因以外，在其前端還存在一段大約160個堿基的衰減子序列，在色氨酸操縱子內部還存在一個二級啟動子，該啟動子位于TrpE基因的上游，TrpD基因的末端，這很可能是對色氨酸生物合成進行調節的經濟性的需要。色氨酸操縱子中的兩個啟動子具有不同的強度，啟動作用受不同的因子調控，可使基因表達更加有效、協調，而且在不同的生活環境中，不同的啟動子精密地調節基因的表達量，對維持細胞的生存起著非常重要的作用。

發明內容

本發明要解決的技術問題在于提供了一種AroI基因及與色氨酸操縱子的串聯表達方法。

為解決上述技術問題，本發明通過以下方案來實現：AroI基因及與色氨酸操縱子的串聯表達方法，其特征在于：所述方法所使用的材料包括菌株、載體、培養基；

所述菌株包括大腸桿菌BL21(DE3)及谷氨酸棒桿菌LG-332；

所述載體包括pMD18T-simple-Trp?cluster載體、pZ8-1(pZ8-1?Shuttle?expression?vector，containing?tac?promoter，mcs，E.coli?ori?from?pACYC177，C.glutamicum?ori?from?pHM1519，Kmr)穿梭表達載體；

所述培養基包括固體完全培養基(g/L)、斜面保藏培養基(g/L)、種子培養基(g/L)、發酵培養基(g/L)；

該方法通過以下步驟實現：

1)谷氨酸棒桿菌HYHI感受態制作：

a、取谷氨酸棒桿菌HYHI單菌落，接種于5ml?LB液體培養基中，37℃振蕩培養至OD600：0.3；

b、將(1)中菌液按3％接入EPO(20ml水+2.5g甘油+0.1mlTween80+80mlLB)，在18℃恒溫振蕩器上以120r/min振蕩培養28h；

c、取出1～2ml菌液檢測OD600是否達到1，當OD600為1時，將菌液冰浴10min；同時冰浴濃度為10％的甘油；

d、取400g冰浴好的菌液，9600r/min離心10min。棄上清，將管倒置于濾紙上，使管內培養液流盡，以收集菌體；

e、每管加入50ml?10％預冷甘油，輕輕吹打，重懸細菌，然后于4℃，4,000rpm離心10min，棄上清，此步驟重復四次；

f、每管加入0.5ml?10％預冷甘油重懸細菌沉淀；

g、分裝至100μl離心管中于-80℃保存備用；

2)、DAHP合成酶基因及突變基因谷氨酸棒桿菌穿梭表達載體的構建：

a、DAHP合成酶基因及突變基因穿梭表達載體引物為：

D1：GGTGGTGGATCCAAAGGAGGACAACCATGAGTTCTCCAGTCTCA?CTCG(下劃線為BamHI酶切位點)；

D2：AAACTGCAGTTAC?TTGGCTGCTGCTCGGCGTTCC(下劃線為PstI酶切位點)；

b、PCR擴增目的基因：以TE溶液稀釋100倍的pMD18T-simple-Aro?I/Aro?I*為模板，以D1、D2為引物PCR條件擴增ZAro?I/ZAro?I*(帶有BamHI和PstI的PCR產物命名為ZAro?I/ZAro?I*)，回收目的基因片段，并連接、轉化、陽性克隆篩選，陽性克隆命名為pMD18T-simple-ZAro?I/ZAro?I*；

c、目的基因與表達載體pZ8-1的酶切：限制性內切酶BamHI和PstI雙酶切重組質粒pMD18T-simple-ZAro?I和pMD18T-simple-ZAro?I*，同時對pZ8-1載體也于37℃恒溫4h進行雙酶切，分別按照下表中體系進行加樣0.8％瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察電泳結果，回收目的基因和載體的目的片段；