[發明專利]AroI基因及與色氨酸操縱子的串聯表達方法

在審

• 申請號: 201310130368.5
• 申請日: 2013-04-10
• 公開（公告）號: CN104099365A
• 公開（公告）日: 2014-10-15
• 發明（設計）人: 劉俊梅;胡耀輝;李琢偉;王丹;王玉華;樸春紅;于寒松;代偉長
• 申請（專利權）人: 吉林農業大學
• 主分類號: C12N15/77
• 分類號: C12N15/77;C12N15/54;C12N9/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.AroI基因及與色氨酸操縱子的串聯表達方法，其特征在于：所述方法所使用的材料包括菌株、載體、培養基；

所述菌株包括大腸桿菌BL21(DE3)及谷氨酸棒桿菌LG-332；

所述載體包括pMD18T-simple-Trp?cluster載體、pZ8-1(pZ8-1?Shuttle?expression?vector，containing?tac?promoter，mcs，E.coli?ori?from?pACYC177，C.glutamicum?ori?from?pHM1519，Kmr)穿梭表達載體；

所述培養基包括固體完全培養基(g/L)、斜面保藏培養基(g/L)、種子培養基(g/L)、發酵培養基(g/L)；

該方法通過以下步驟實現：

1)谷氨酸棒桿菌HYHI感受態制作：

a、取谷氨酸棒桿菌HYHI單菌落，接種于5ml?LB液體培養基中，37℃振蕩培養至OD600：0.3；

b、將(1)中菌液按3％接入EPO(20ml水+2.5g甘油+0.1mlTween80+80mlLB)，在18℃恒溫振蕩器上以120r/min振蕩培養28h；

c、取出1～2ml菌液檢測OD600是否達到1，當OD600為1時，將菌液冰浴10min；同時冰浴濃度為10％的甘油；

d、取400g冰浴好的菌液，9600r/min離心10min。棄上清，將管倒置于濾紙上，使管內培養液流盡，以收集菌體；

e、每管加入50ml?10％預冷甘油，輕輕吹打，重懸細菌，然后于4℃，4,000rpm離心10min，棄上清，此步驟重復四次；

f、每管加入0.5ml?10％預冷甘油重懸細菌沉淀；

g、分裝至100μl離心管中于-80℃保存備用；

2)、DAHP合成酶基因及突變基因谷氨酸棒桿菌穿梭表達載體的構建：

a、DAHP合成酶基因及突變基因穿梭表達載體引物為：

D1：GGTGGTGGATCCAAAGGAGGACAACCATGAGTTCTCCAGTCTCACTCG(下劃線為BamHI酶切位點)；

D2：AAACTGCAGTTAC?TTGGCTGCTGCTCGGCGTTCC(下劃線為PstI酶切位點)；

b、PCR擴增目的基因：以TE溶液稀釋100倍的pMD18T-simple-Aro?I/AroI*為模板，以D1、D2為引物PCR條件擴增ZAro?I/ZAro?I*(帶有BamHI和PstI的PCR產物命名為ZAroI/ZAro?I*)，回收目的基因片段，并連接、轉化、陽性克隆篩選，陽性克隆命名為pMD18T-simple-ZAro?I/ZAro?I*；

c、目的基因與表達載體pZ8-1的酶切：限制性內切酶BamHI和PstI雙酶切重組質粒pMD18T-simple-ZAro?I和pMD18T-simple-ZAro?I*，同時對pZ8-1載體也于37℃恒溫4h進行雙酶切，分別按照下表中體系進行加樣0.8％瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察電泳結果，回收目的基因和載體的目的片段；

d、回收片段的連接：將回收的帶有粘性末端的AroI和AroI*基因的ORF片段及載體片段用T4?DNA連接酶進行連接，連接體系按下表成分用量連接過夜；

e、重組載體轉化、鑒定：將重組載體轉化，然后進行酶切與PCR鑒定，正確的重組質粒進行序列測定，測序驗證正確的載體分別命名為pZ8-1-Aro?I和pZ8-1-Aro?I*，再電轉入谷氨酸棒桿菌LG-332感受態細胞中，其中陽性克隆的篩選標記抗生素為卡那霉素，篩選濃度為25mg/l，Aro?I和Aro?I*在谷氨酸棒桿菌LG-332中的誘導表達、SDS-PAGE電泳、表達產物生物學活性的測定和比較；

3)、谷氨酸棒桿菌Trp?Cluster與pZ8-1-Aro?I和pZ8-1-Aro?I*串連表達載體構建谷氨酸棒桿菌Trp?Cluster與pZ8-1-Aro?I和pZ8-1-Aro?I*串連表達載體構建：

a、pMD18T-simple-Trp?cluster載體與表達載體pZ8-1-Aro?I和pZ8-1-Aro?I*的酶切：限制性內切酶BamHI單酶切重組質粒pMD18T-simple-Trp?cluster和pZ8-1-Aro?I和pZ8-1-Aro?I*，于30℃恒溫過夜進行單酶切，按下表體系進行加樣，0.8％瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察電泳結果，回收目的基因和載體目的片段；

b、載體去磷酸化：為防止單酶切載體的自連，按下表體系加樣，50℃水浴1h，0.8％瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察電泳結果，回收去磷酸化的載體目的片段；

c、回收片段的連接：將回收的Trp?cluster基因片段及載體片段用T4?DNA連接酶進行連接，連接體系見下表，16℃連接過夜；

d、重組載體轉化、鑒定：將重組載體轉化，然后進行酶切與PCR鑒定，正確的重組質粒進行序列測定，測序驗證正確的載體分別命名為pZ8-1-Trpcluster-Aro?I?and?pZ8-1-Trp?cluster-Aro?I*，再電轉入谷氨酸棒桿菌LG-332中，其中陽性克隆的篩選標記抗生素為卡那霉素，篩選濃度為25mg/l；

e、pZ8-1-Trp?cluster-Aro?I和pZ8-1-Trp?cluster-Aro?I*在E.coli中的誘導表達、SDS-PAGE電泳；

f、DAHP合成酶、鄰氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶酶生物活性測定分析：誘導結束后，培養液于4℃離心收集菌體，用0.1mol/L?pH7.8Tris-HCl緩沖液洗滌2次，按1g濕菌懸于5ml緩沖液中的比例制備懸液，在冰浴條件下超聲破碎處理，30×4s，200W，4℃10000r/min離心20min，上清即為粗酶液，用于酶活性測定，對鄰氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的活性進行初步測定；

4)、色氨酸定量分析：L-色氨酸含量測定，采用高效液相色譜法測定，色譜條件為C18分離柱(150mm×6.0mm?Shimazu?Co.Ltd.)；流動相，含15％甲醇的0.02mol/L?NaAc緩沖溶液(pH＝4.5)；流動相流速，0.6mL/min；紙速，0.25cm/min；檢測波長，UV280nm；外標法定量；

5)、重組表達載體pZ8-1-Aro?I/Aro?I*的鑒定：分別挑取兩組轉化平板菌落，對其進行菌落PCR檢測，均能擴增出約1.1Kb的特異條帶，大小與預期相符，選取PCR檢測陽性的菌落培養后抽提質粒以BamHI和PstI進行雙酶切，均能切出一條約1.1Kb的條帶，與預期結果相一致，將菌落PCR及雙酶切檢測均呈陽性的pZ8-1-Aro?I/Aro?I*質粒進行測序；

6)、重組串聯表達載體pZ8-1-Trp?cluster-Aro?I/Aro?I*的鑒定：分別挑取兩組轉化平板菌落，對其進行菌落PCR檢測，均能擴增出約1.1Kb及7.1kb的特異條帶，大小與預期相符，選取PCR檢測陽性的菌落培養后抽提質粒以BamHI和PstI進行雙酶切，均能切出一條約1.1Kb的條帶，與預期結果相一致，且BamHI單酶切可切出7kb左右的片段，將菌落PCR及雙酶切檢測均呈陽性的pZ8-1-Trpcluster-Aro?I/Aro?I*質粒進行測序；

7)、重組質粒pZ8-1-Aro?I/Aro?I*的誘導表達：在谷氨酸棒桿菌中，經IPTG誘導，相對于未誘導菌株對照，經SDS-PAGE分析表明pZ8-1-Aro?I/Aro?I*誘導后，明顯表達約40KDa的特異蛋白，可溶性分析顯示，融合蛋白以胞內可溶性形式存在，與預期的相對分子量基本相一致；

8)、重組串聯表達載體pZ8-1-Trp?cluster-Aro?I/Aro?I*的誘導表達：在谷氨酸棒桿菌中，經IPTG誘導，相對于未誘導重組質粒pZ8-1-Aro?I/Aro?I*對照，經SDS-PAGE分析表明pZ8-1-Trp?cluster-Aro?I/Aro?I*誘導后，明顯表達約40KDa的特異蛋白，可溶性分析顯示，融合蛋白以胞內可溶性形式存在，與預期的相對分子量基本相一致，轉化后的谷氨酸棒桿菌經IPTG誘導表達后，從SDS-PAGE電泳結果看，在大約56KD、53KD、29KD處明顯有條帶加深，說Trp-cluster基因簇獲得了表達，大小與理論相符。