[發(fā)明專利]新型麥芽寡糖基海藻糖水解酶、酶基因、含該基因的重組表達(dá)載體及重組工程菌及酶的制備

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310128714.6
• 申請(qǐng)日: 2013-04-15
• 公開（公告）號(hào): CN103194434A
• 公開（公告）日: 2013-07-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳平平;張全景;付吉明;劉敏;莊祎;王喬隆;李慧君;鄭秀寧
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東天力藥業(yè)有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/24
• 分類號(hào): C12N9/24;C12N15/56;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 濟(jì)南泉城專利商標(biāo)事務(wù)所 37218
• 代理人: 李桂存

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域，具體涉及麥芽寡糖基海藻糖水解酶及其表達(dá)基因、含有該基因的重組表達(dá)載體及重組工程菌，以及利用含有該基因的重組工程菌制備該酶的方法。

背景技術(shù)

海藻糖?(Trehalose)是一種由兩個(gè)葡萄糖分子通過半縮醛羥基以α?-1,1糖苷鍵結(jié)合的非還原性糖，分子式為C₁₂H₂₂O₁₁，相對(duì)分子量為378.33。其結(jié)構(gòu)式如圖1所示：

圖1??海藻糖的分子結(jié)構(gòu)

海藻糖廣泛存在于細(xì)菌、酵母、真菌、藻類、昆蟲和植物中。它對(duì)生物體和生物大分子具有非特異性的保護(hù)作用。這種非特異性保護(hù)作用主要體現(xiàn)在，當(dāng)生物細(xì)胞處于饑餓、干燥、高溫、低溫冷凍、輻射、高滲透壓及有毒試劑等各種脅迫環(huán)境時(shí)，胞內(nèi)海藻糖含量迅速上升，從而保護(hù)生命本身。

外源性的海藻糖同樣對(duì)生物體和生物大分子有非特異性的保護(hù)作用，海藻糖這種獨(dú)特的生物學(xué)性質(zhì)，使其廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域。

目前海藻糖的生產(chǎn)工藝分為三種：

（1）提取法

酵母在惡劣的環(huán)境下（饑餓、高溫、高滲、高壓）生長(zhǎng)，酵母體內(nèi)能夠積累大量海藻糖，大約占菌體干重的15%。因此最初海藻糖的生產(chǎn)采用從酵母體內(nèi)提取的方法。在酵母細(xì)胞內(nèi)，由于海藻糖屬胞內(nèi)產(chǎn)物，合成受外界環(huán)境條件的影響較大，且分離提取困難，因而用此法生產(chǎn)海藻糖的產(chǎn)量較低，商品化生產(chǎn)的發(fā)酵水平為0.4-0.6%，成本較高，此種生產(chǎn)方法海藻糖價(jià)格昂貴。

（2）單酶法

1995年，日本林原生化研究所從Pimelobacter、Psceuclomonus和Thermus三屬微生物中分離純化了一種新型淀粉酶—海藻糖合酶，它可以轉(zhuǎn)化麥芽糖為海藻糖，并申請(qǐng)了專利CN1106065A。此后我國(guó)科研單位也相繼從不同細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了海藻糖合酶并進(jìn)行基因工程表達(dá)，例如CN200410013007.3、CN200910114318.1、CN200910007259.8、CN201010614814.6、CN201010614832.4、CN201210160403.3、CN201210011457.3，其中棲熱菌屬海藻糖合酶具有80℃的熱穩(wěn)定性。隨著反應(yīng)溫度升高，海藻糖合酶轉(zhuǎn)化麥芽糖生產(chǎn)海藻糖的轉(zhuǎn)化率會(huì)下降，40℃麥芽糖對(duì)海藻糖的轉(zhuǎn)化率可達(dá)到80%，60℃轉(zhuǎn)化率約為60%。目前還沒有利用該工藝大規(guī)模生產(chǎn)海藻糖的報(bào)道。

（3）雙酶法

1994年林原生化研究所發(fā)現(xiàn)了新型海藻糖合成酶—麥芽寡糖基海藻糖合成酶（malt?ooligosyl?tehalose?synthase，MTSase）和水解酶（maltooligosyl?trehalose?hydrolase,?MTHase），雙酶聯(lián)合作用于淀粉水解物產(chǎn)生海藻糖，首先MTSase作用于淀粉水解物，淀粉水解物末端形成海藻糖單元，然后MTHase切割掉末端海藻糖，形成一分子海藻糖和少兩個(gè)葡萄糖基的淀粉水解物。

目前以還原性淀粉水解物為原料，雙酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)海藻糖是最經(jīng)濟(jì)的工藝路線，仍存在以下問題：

（1）專利CN99123896.6提供了最適溫度50℃和最適pH6.0的MTSase和MTHase，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到80%，目前日本林原生化研究所已利用該技術(shù)實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。50℃雙酶轉(zhuǎn)化容易染菌，此外淀粉水解物需要普魯蘭酶脫支處理。目前商品普魯蘭酶最適溫度為55-60℃，最適pH5.0-5.5，pH6.0時(shí)活力較低，導(dǎo)致普魯蘭酶和雙酶共同轉(zhuǎn)化淀粉生產(chǎn)海藻糖時(shí)效率較低，轉(zhuǎn)化時(shí)間達(dá)到48?h以上。

（2）文獻(xiàn)Production?of?Trehalose?from?Starch?by?Thermostable?Enzymes?from?Sulfolo?bus?acidocaldarius（DOI:10.1002/star.19970490107）報(bào)道了嗜酸熱硫化葉菌可產(chǎn)最適溫度75℃和最適pH5.5左右的MTSase和MTHase。該雙酶雖然具有較高的最適反應(yīng)溫度和較低的最適pH，但是文獻(xiàn)報(bào)道該雙酶活力均很低。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種麥芽寡糖基海藻糖水解酶（簡(jiǎn)稱MTHase，下同），該酶具有較高的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性，提高了生產(chǎn)海藻糖的穩(wěn)定性，和普魯蘭酶具有相同的最適pH，顯著提高了其和普魯蘭酶聯(lián)合生產(chǎn)海藻糖的效率。

本發(fā)明還提供了一種表達(dá)該水解酶的基因、含有該基因的重組表達(dá)載體和重組工程菌，該基因表達(dá)量高，使酶成本顯著降低，也進(jìn)一步降低了制備海藻糖的成本。