[發(fā)明專利]一種檢測AP2α轉(zhuǎn)錄因子活性的報告基因載體

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310123262.2
• 申請日: 2013-04-10
• 公開（公告）號: CN103305550A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李廷玉;畢楊;陳潔;龔敏;魏小平;侯娜麗
• 申請（專利權(quán)）人: 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/65;C12Q1/68
• 代理公司: 重慶弘旭專利代理有限責(zé)任公司 50209
• 代理人: 周韶紅

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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種攜帶轉(zhuǎn)錄因子AP2α順式作用元件的熒光素酶報告基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體及其構(gòu)建方法。?

技術(shù)背景

轉(zhuǎn)錄因子AP2是一個分子量為52-kDa?的轉(zhuǎn)錄激活因子，定位于細胞核，具有獨特的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，通常以二聚體形式結(jié)合到DNA豐富GC的元件上，特異性調(diào)控基因表達，特異性調(diào)控基因表達，參與脊椎動物生長發(fā)育，細胞增殖分化，并可雙向調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生，而其自身也受到多種信號分子及蛋白的影響。研究發(fā)現(xiàn)AP2轉(zhuǎn)錄因子對視黃酸特別敏感，可受視黃酸信號途徑的調(diào)控，在視黃酸誘導(dǎo)的形態(tài)發(fā)生中，AP2的mRNA水平與視黃酸敏感的發(fā)育時期呈正相關(guān)，視黃酸核受體RARs可調(diào)控AP2的表達，用拮抗劑阻止RAR功能導(dǎo)致胚胎小鼠眼組織中AP2陽性細胞明顯減少。

現(xiàn)已經(jīng)有5個AP2基因被確定，分別編碼AP2α、AP2β、AP2γ、AP2δ和AP2??蛋白，各亞型的表達與特定的細胞類型有關(guān)。其中，AP2α與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育密切相關(guān)。在小鼠胚胎發(fā)育中，AP2α主要表達于神經(jīng)脊細胞，顱面部及脊柱的感覺神經(jīng)節(jié)中，調(diào)控與周圍神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄。AP2α敲除可導(dǎo)致小鼠在胚胎期死亡，并出現(xiàn)無腦畸形和神經(jīng)管發(fā)育缺陷。AP2α還參與多種神經(jīng)相關(guān)基因的調(diào)控，如：前腦啡肽原，乙酰膽堿酯酶、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶、烯醇化酶、突觸蛋白、多巴胺羥化酶和兒茶酚胺合成酶等。AP2α在成年鼠腦內(nèi)的表達模式提示AP2α除了在早期發(fā)育過程起重要作用外，對神經(jīng)元的表型決定和功能特征的維持也有舉足輕重的作用。我們的前期實驗發(fā)現(xiàn)，全反式維甲酸（all-trans?retinoic?acid，ATRA）可促進骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)細胞方向，可能是通過調(diào)控AP2α的轉(zhuǎn)錄活性來實現(xiàn)的，我們希望進一步探討AP2α的轉(zhuǎn)錄活性在維甲酸信號通路調(diào)控MSCs神經(jīng)分化中的作用及具體的分子機制。

目前，檢測AP2α的轉(zhuǎn)錄活性的方法是采用顯性負性突變體。顯性負性突變體是功能冗余的基因突變，不僅自身結(jié)構(gòu)發(fā)生變化失去正常的生物學(xué)功能，還能與同一細胞內(nèi)的野生型信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白進行競爭性抑制，從而阻斷野生型蛋白的生物學(xué)作用。AP2α具有特殊的蛋白結(jié)構(gòu)，其N端是富含脯氨酸和谷氨酸的反式轉(zhuǎn)錄激活域（TAD），C端為堿性DNA結(jié)合區(qū)（basic?DNA?binding?domain,?bDBD）和堿性螺旋-環(huán)-螺旋（basic-helix-loop-helix,?HLH?)二聚體結(jié)構(gòu)，與特異的DNA序列結(jié)合，調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。采用缺失突變的方法分別構(gòu)建缺失bHLH區(qū)域和缺失TAD區(qū)域的兩個顯性負性突變體腺病毒，感染MSCs，EMSA檢測發(fā)現(xiàn)dnAP2α-△TAD對AP2α特異性順式作用元件DNA序列的結(jié)合顯著增多，由于dnAP2α-△TAD保留了DNA結(jié)合域，EMSA不能如實反映該突變體對AP2α轉(zhuǎn)錄活性的抑制。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個目的在于獲得一種攜帶轉(zhuǎn)錄因子AP2α順式作用元件的熒光素酶報告基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，能快速、方便、準確地檢測細胞中的AP2α轉(zhuǎn)錄因子活性。

一種報告基因載體，含有AP2α特異性順式作用元件，其特征在于所述AP2α特異性順式作用元件是由4個GCCCGCGGTT串聯(lián)組成。

上述4個GCCCGCGG核苷酸序列的串聯(lián)連接，帶來對AP2α的高親和性，但是相對的提高了產(chǎn)生非特異性的錯誤識別的幾率，而影響AP2α的轉(zhuǎn)錄活性的檢測；通過巧妙設(shè)置序列TT，使之不易在順式作用元件內(nèi)部產(chǎn)生錯誤識別。所示報告基因載體對于轉(zhuǎn)錄因子AP2α的特異性結(jié)合力強，且不易產(chǎn)生錯誤識別，具有高親和力和高特異性的特點。

上述報告基因載體，含有SEQ?ID?NO.5所示的序列或SEQ?ID?NO.5互補序列。

上述報告基因載體來源于pBGLuc逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。

上述報告基因載體攜帶天然分泌型報告熒光素酶Gaussia?luciferas，以及殺稻瘟菌素抗性基因。

上述報告基因載體，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。AP2α特異性順式作用元件插入至熒光素酶Gaussia?luciferase報告基因上游、5’-LTR可啟動殺稻瘟菌素抗性基因的表達，抗性篩選可用于建立穩(wěn)定細胞株。

本發(fā)明的另外一個目的在于提供上述報告基因載體的制備方法，主要通過以下步驟實現(xiàn)：

（1）體外退火獲得4個串聯(lián)的所述AP2α特異性順式作用元件的DNA雙鏈，雙鏈兩端帶有BamHⅠ和MluⅠ酶切位點；