[發(fā)明專利]一種檢測(cè)AP2α轉(zhuǎn)錄因子活性的報(bào)告基因載體

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310123262.2
• 申請(qǐng)日: 2013-04-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103305550A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-09-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李廷玉;畢楊;陳潔;龔敏;魏小平;侯娜麗
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N15/867
• 分類號(hào): C12N15/867;C12N15/65;C12Q1/68
• 代理公司: 重慶弘旭專利代理有限責(zé)任公司 50209
• 代理人: 周韶紅

1.一種報(bào)告基因載體，含有AP2α特異性順式作用元件，其特征在于所述AP2α特異性順式作用元件是由4個(gè)GCCCGCGGTT串聯(lián)組成。

2.如權(quán)利要求1所述的報(bào)告基因載體，含有SEQ?ID?NO.5所示的序列或SEQ?ID?NO.5互補(bǔ)序列。

3.如權(quán)利要求1或2所述的報(bào)告基因載體，來(lái)源于pBGLuc逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。

4.如權(quán)利要求1、2或3所述的報(bào)告基因載體，攜帶天然分泌型報(bào)告熒光素酶Gaussia?luciferas，以及殺稻瘟菌素抗性基因。

5.如權(quán)利要求1～4任一所述的報(bào)告基因載體，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。

6.如權(quán)利要求1～5任一所述的報(bào)告基因載體的制備方法，包括以下步驟：

（1）體外退火獲得4個(gè)串聯(lián)的所述AP2α特異性順式作用元件的DNA雙鏈，雙鏈兩端帶有BamHⅠ和MluⅠ酶切位點(diǎn)；

（2）將上述DNA雙鏈定向克隆至pBGLuc逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，采用殺稻瘟菌素抗性基因序列及AP2α特異性順式作用元件匹配的成對(duì)引物進(jìn)行鑒定，測(cè)序正確后獲得pBGLuc-AP2α-RE報(bào)告基因載體。

7.如權(quán)利要求1～6任一所述的報(bào)告基因載體的制備方法，包括以下步驟：

（1）獲取AP2α特異性順式作用元件：設(shè)計(jì)4個(gè)串聯(lián)的AP2α特異性順式作用元件序列，上游和下游序列分別符合SEQ?ID?NO.1?&?SEQ?ID?NO.2的核苷酸序列，體外退火獲得DNA雙鏈；退火后形成的雙鏈DNA片段帶有BamHⅠ及MluⅠ的酶切位點(diǎn);

（2）pBGLuc-AP2α-RE報(bào)告基因載體的構(gòu)建：將DNA雙鏈片段定向插入至逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBGLuc的Gaussian?luciferase基因上游,采用SEQ?ID?NO.3?&?SEQ?ID?NO.4分別作為上游和下游引物進(jìn)行鑒定；

（3）檢測(cè)MSCs中AP2α的轉(zhuǎn)錄活性：將pBGLuc-AP2α-RE轉(zhuǎn)染大鼠MSCs，腺病毒介導(dǎo)顯性負(fù)性突變體過(guò)表達(dá)，再加入ATRA誘導(dǎo)24小時(shí)后檢測(cè)培養(yǎng)上清中分泌的熒光素酶活性。