[發(fā)明專利]一種優(yōu)秀冰雪運動員EB病毒轉(zhuǎn)化B淋巴細胞的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310123132.9
• 申請日: 2013-04-11
• 公開（公告）號: CN103232971A
• 公開（公告）日: 2013-08-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐金慶;朱紅;費郁紅;張文秀;王會;關(guān)偉軍
• 申請（專利權(quán)）人: 哈爾濱體育學院
• 主分類號: C12N5/0781
• 分類號: C12N5/0781;A01N1/02;C12R1/91
• 代理公司: 暫無信息
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1.一種高細胞轉(zhuǎn)化率、高細胞無限增殖的優(yōu)秀運動員永生化細胞株。

2.如權(quán)利要求1所述方法是，一種高細胞轉(zhuǎn)化率、高細胞無限增殖的優(yōu)秀運動員永生化細胞株的培養(yǎng)方法，其特征在于，該方法包括下述步驟：

2.1血樣采集

(1)記錄采血運動員個人資料，與抽血管上的編號相對應(yīng)；

(2)使用帶有肝素鈉的一次性抽血管，抽取運動員靜脈血4ml/人；

(3)血樣常溫靜止放置1～2d；

注：如果全血當時不能馬上轉(zhuǎn)化，必須做如下處理：將血樣在常溫下2500rpm，離心15min，離心后用巴氏管將白膜層轉(zhuǎn)入含有3ml?1640全培養(yǎng)基的離心管內(nèi)，然后將離心管放入37.5℃培養(yǎng)箱，置于方盤上。

2.2細胞永生化

(1)用加1％的雙抗的RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將采集的運動員血液稀釋，輕輕吹勻。

(2)淋巴細胞分離液置于37.5℃水浴鍋中預(yù)熱，使用時將其溶液搖勻。

(3)往裝有運動員血樣的15ml離心管中慢慢倒入4ml淋巴細胞分離液，使二者界面清晰，3000rpm離心10min，使血液分層；

(4)離心后離心管中分為四層，將血清下層、紅細胞上層的成楊絮狀的白膜層，用巴氏管移入裝有6ml?RPMI1640培養(yǎng)基的離心管中，1000rpm離心10min；

(5)離心后將上清液棄掉，再加入10ml?RPMI1640培養(yǎng)基，1000rpm離心10min，棄上清液。重復(fù)一次后，棄去上清液，將細胞敲勻待用；

(6)將2ml含PHA的全培養(yǎng)基、1.4ml?EB病毒、0.4ml?CyA以及收集到的白細胞做成混合液，共約4ml；

(7)將混合液加入到24孔培養(yǎng)板中，每孔1ml；

(8)將24孔培養(yǎng)板置于37.5℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.運動員永生化細胞系的培養(yǎng)及凍存

3.1細胞的傳代

(1)永生化細胞從24孔板轉(zhuǎn)移到25m²的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)；

(2)3～4d進行一次半量換液，每次半量換液即為一次細胞傳代。

3.2細胞的凍存

(1)收集細胞懸液，1000rpm離心10min，棄上清；

(2)向離心管中加入預(yù)定量的凍存液，將細胞輕輕打勻，調(diào)整細胞密度為1×10⁶/ml～3×10⁶/ml，將凍存液分裝到凍存管中，每管1ml；

(3)預(yù)凍：將凍存管裝入降溫盒中，放于4℃20～30min，然后置于一70℃預(yù)凍4h以上，提出凍存管放入

(4)凍存：提出凍存管放入液氮柜中，即完成細胞凍存。