[發明專利]一種用于轉基因抗蟲玉米基因特異性檢測的質粒分子及其制備和應用方法

無效

• 申請號: 201310122382.0
• 申請日: 2013-04-09
• 公開（公告）號: CN103205498A
• 公開（公告）日: 2013-07-17
• 發明（設計）人: 孫紅煒;楊淑珂;張廣遠;高瑞;徐曉輝;李凡;路興波
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/63;C12N15/66;G01N21/64
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 楊琪

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，涉及轉基因玉米MIR162Vip3Aa20基因質粒分子pVZ的構建及其在轉基因玉米定量檢測中的應用。

背景技術

截至2011年，全球轉基因種植面積已達到1.6億公頃，其中轉基因玉米種植面積居第一位。作為我國最重要的糧食作物之一，國內轉基因玉米研發工作進展也較為迅速，目前有多個轉基因玉米優良品系進入環境釋放階段，申請商業化種植，其中轉植酸酶玉米已經獲得安全評價證書。轉基因作物迅猛發展的同時，也伴隨著人們對其環境安全和食用安全的關注和質疑。研究、制定轉基因作物及其產品成分檢測標準，對于加強轉基因作物安全管理，防止轉基因作物未經安全批準進入生產流通環節；保障轉基因生物安全和人類健康，保護消費者利益；消除公眾對于轉基因作物安全性的疑慮，營造良好的轉基因作物產業化氛圍具有重要意義。

質粒分子（Plasmid?Molecule）作為一種新的DNA標準物質具有容易獲得、使用方便、純度易控制和均勻性好等優點，被越來越多的應用在轉基因產品定量檢測中。研究、構建轉植酸酶基因玉米陽性質粒分子，對于加強該品種的安全管理，保護消費者利益，消除公眾對于轉基因作物安全性的疑慮，營造良好的轉基因作物產業化氛圍具有重要意義。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于轉基因抗蟲玉米基因特異性檢測的質粒分子及其制備和應用方法。

本發明的技術方案如下：

一種用于轉基因抗蟲玉米基因特異性檢測的質粒分子，以pMD19-T為載體，通過連接酶連接PCR擴增產物，PCR擴增產物包括含轉基因玉米MIR162Vip3Aa20基因特異性序列和玉米內標基因zSSIIb特異性序列。該質粒分子的特異性序列如下：

GCGAAGAGCGTGACCAAGAACGACGTGGACGGCTTCGAGTTCTACCTGAACACCTTCCACGACGTGATGGTGGGCAACAACCTGTTCGGCCGCAGCGCCCTGAAGACCGCCAGCGAGCTGATCACCAAGGAGAACGTGAAGACCAGCGGCAGCGAGGTGGGCAACGTGTACAACTTCCTGATCGTGCTGACCGCCCTGCAGGCCCAGGCCTTCCTGACCCTGACCACCTGTGAAGCCAGAGCCCGCAGGCCATCGCTGAACCGGTGGATGCTAAGGCTGATGCAGCTCCGGCTACAGATGCGGCGGCGAGTGCTCCTTATGACAGGGAGGATAATGAACCTGGCCCTTTGGCTGGGCCTAATGTGATGAACGTCGTCGT，如SEQ?ID?NO.1所示。

所述的用于轉基因抗蟲玉米基因特異性檢測的質粒分子的制備方法，包括步驟如下：

（1）根據轉基因玉米MIR162Vip3Aa20基因序列和玉米內標基因序列設計引物，引物序列如下：

C-Vip3Aa20-1F:5'-GCGAAGAGCGTGACCAAGA-3'，SEQ?ID?NO.2所示，

C-Vip3Aa20-2R:5'-GCGGGCTCTGGCTTCACAGGTGGTCAGGGTCAGGAA-3'，如SEQ?ID?NO.3所示，

C-zSSIIb-1F:5'-TTCCTGACCCTGACCACCTGTGAAGCCAGAGCCCGC-3'，SEQ?ID?NO.4所示，

C-zSSIIb-2R:5'-ACGACGACGTTCATCACATTAGG-3'，SEQ?ID?NO.5所示；

（2）用引物C-Vip3Aa20-1F/C-Vip3Aa20-2R和C-zSSIIb-1F/C-zSSIIb-2R分別進行PCR擴增獲得含轉基因玉米MIR162Vip3Aa20轉化體特異性基因序列和玉米內標基因zSSIIb特異性序列的DNA片段；回收這兩個目的片段，以此為模板采用引物C-Vip3Aa20-1F/C-zSSIIb-2R進行重疊PCR擴增；

（3）將得到的PCR產物回收后通過連接酶連接到pMD19-T載體上，連接后的產物轉化至大腸桿菌DH5α，將得到的克隆產物大量培養后提取質粒得到質粒分子pVZ。