[發明專利]一種用于轉基因抗蟲玉米基因特異性檢測的質粒分子及其制備和應用方法

無效

• 申請號: 201310122382.0
• 申請日: 2013-04-09
• 公開（公告）號: CN103205498A
• 公開（公告）日: 2013-07-17
• 發明（設計）人: 孫紅煒;楊淑珂;張廣遠;高瑞;徐曉輝;李凡;路興波
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/63;C12N15/66;G01N21/64
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 楊琪

1.一種用于轉基因抗蟲玉米基因特異性檢測的質粒分子，其特征是，以pMD19-T為載體，通過連接酶連接PCR擴增產物，PCR擴增產物包括含轉基因玉米MIR162Vip3Aa20基因特異性序列和玉米內標基因zSSIIb特異性序列。

2.根據權利要求1所述的一種用于轉基因抗蟲玉米基因特異性檢測的質粒分子，其特征是，所述的含轉基因玉米MIR162Vip3Aa20基因特異性序列和玉米內標基因zSSIIb特異性序列為：

GCGAAGAGCGTGACCAAGAACGACGTGGACGGCTTCGAGTTCTACCTGAACACCTTCCACGACGTGATGGTGGGCAACAACCTGTTCGGCCGCAGCGCCCTGAAGACCGCCAGCGAGCTGATCACCAAGGAGAACGTGAAGACCAGCGGCAGCGAGGTGGGCAACGTGTACAACTTCCTGATCGTGCTGACCGCCCTGCAGGCCCAGGCCTTCCTGACCCTGACCACCTGTGAAGCCAGAGCCCGCAGGCCATCGCTGAACCGGTGGATGCTAAGGCTGATGCAGCTCCGGCTACAGATGCGGCGGCGAGTGCTCCTTATGACAGGGAGGATAATGAACCTGGCCCTTTGGCTGGGCCTAATGTGATGAACGTCGTCGT。

3.權利要求1所述的轉基因抗蟲玉米基因特異性檢測的質粒分子的制備方法，其特征是，包括步驟如下：

（1）根據轉基因玉米MIR162Vip3Aa20基因序列和玉米內標基因序列設計引物與探針，引物與探針序列如下：

C-Vip3Aa20-1F:5'-GCGAAGAGCGTGACCAAGA-3'

C-Vip3Aa20-2R:5'-GCGGGCTCTGGCTTCACAGGTGGTCAGGGTCAGGAA-3'

C-zSSIIb-1F:5'-TTCCTGACCCTGACCACCTGTGAAGCCAGAGCCCGC-3'

C-zSSIIb-2R:5'-ACGACGACGTTCATCACATTAGG-3'；

（2）用引物C-Vip3Aa20-1F/C-Vip3Aa20-2R和C-zSSIIb-1F/C-zSSIIb-2R分別進行PCR擴增獲得含轉基因玉米MIR162Vip3Aa20基因特異性序列和玉米內標基因zSSIIb特異性序列的DNA片段；回收這兩個目的片段，以此為模板采用引物C-Vip3Aa20-1F/C-zSSIIb-2R進行重疊PCR擴增；

（3）將得到的PCR產物回收后通過連接酶連接到pMD19-T載體上，連接后的產物轉化至大腸桿菌DH5α，將得到的克隆產物大量培養后提取質粒得到質粒分子pVZ。

4.根據權利要求1所述的所述的轉基因抗蟲玉米基因特異性檢測的質粒分子的制備方法，其特征是，步驟（2）所述的PCR擴增具體步驟為：以C-Vip3Aa20-1F/C-Vip3Aa20-2R和C-zSSIIb-1F/C-zSSIIb-2R為上、下游引物，在Premix?Ex?Taq(Takara)擴增體系中，加入轉基因玉米MIR162模板DNA，先95℃擴增5min，再95℃擴增30s，再58℃擴增30s，然后72℃擴增30s，這樣進行35個循環，最后在72℃擴增7min。

5.權利要求1所述的質粒分子作為轉基因玉米MIR162標準品的替代品在SYBR?Green?I實時熒光定量檢測玉米及其相關產品是否含有轉基因玉米MIR162成分中的應用。