[發明專利]一株檸檬酸高產菌株及其篩選方法

有效

• 申請號: 201310122164.7
• 申請日: 2013-04-10
• 公開（公告）號: CN103194398A
• 公開（公告）日: 2013-07-10
• 發明（設計）人: 王德培;寇光智;李昌濤;周一江;劉劍雄;高曉彤
• 申請（專利權）人: 日照魯信金禾生化有限公司;天津科技大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N13/00;C12Q1/04;C12R1/685
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司 37205
• 代理人: 苗峻

技術領域

本發明涉及生物發酵領域，涉及一株采用航天誘變手段獲得的黑曲霉孢子，并通過耐受高糖高酸的定向篩選獲得高產檸檬酸菌株。

背景技術

檸檬酸(Citric?acid)又名枸櫞酸，為白色顆粒狀或白色結晶粉末，相對密度為1.6550，無臭，具有令人愉快的強烈的酸味，入口爽快，無后酸味，安全無毒，被廣泛用作食品和飲料的酸味劑，全球范圍內檸檬酸的生產主要通過產檸檬酸的黑曲霉發酵，黑曲霉屬半知菌綱，一般只進行無性繁殖，由孢子發芽開始到新孢子形成，為一個生活周期。黑曲霉利用糖類發酵生成檸檬酸，其生物合成途徑現普遍認為是：葡萄糖經EMP、HMP途徑降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脫羧生成乙酰CoA，另一方面經CO₂固定化反應生成草酰乙酸，草酰乙酸與乙酰CoA縮合生成檸檬酸。

檸檬酸的工業生產通常采用黑曲霉進行的深層發酵法，原料以薯干和玉米為主。世界檸檬酸工業的集約化程度非常高，除中國外，國外主要的檸檬酸制造商只有5～6家（美國、奧地利、加拿大、巴西等），到2011年我國檸檬酸產量達94萬噸，占世界總產量的70%左右，從產量來說是名副其實的生產大國。我國檸檬酸工業的集約化已經達到世界領先水平。隨著工業的發展人們對含檸檬酸產品的需求增加，而黑曲霉菌株的產酸能力是制約檸檬酸生產能力的一個瓶頸。因此篩選獲得高產檸檬酸的黑曲霉菌株具有重大意義。

國內外有很多關于檸檬酸生產菌黑曲霉育種的研究報道，主要是采用物理和化學手段進行誘變育種。各種誘變劑有其作用的特殊性，人們還無法針對某一目的選擇最適宜的誘變劑，在實際工作中一般都是根據經驗來證明誘變效果較好的因素。自從上世紀初開始用微生物生產檸檬酸以來，人們對生產檸檬酸的菌種進行了幾十年的誘變研究。我國在檸檬酸生產菌黑曲霉的育種方面積累了豐富的經驗，認為用復合誘變的方法比用單一的物理方法或化學方法更為有效。目前來看對黑曲霉育種較為有效的誘變因子有：γ-射線、x-射線、紫外線、激光、亞硝基胍(NTG)、亞硝基脲、乙基胺等，此外還有高能電子流、電磁場等。利用這些誘變因子在黑曲霉育種工作中已取得了不少成果。

20世紀50年代末和60年代初，金其榮等人進行了檸檬酸發酵的菌種研究。上海工業微生物研究所，從土壤中經酸性平板分離獲得的野生黑曲霉628作為出發菌株，經多次60Co-γ射線和硫酸二乙脂等復合誘變，獲得了高產檸檬酸菌株Co827。它可直接利用薯干粉發酵，產酸達12～13%，平均轉化率為95%，發酵周期54～64h。無錫工業大學以黑曲霉H-142為出發菌株，通過γ射線、硫酸二乙脂、高溫單獨或復合誘變處理，通過高溫、高酸及高滲培養條件的定向篩選獲得HQL-601菌種。它的發酵溫度為40～41℃，周期60～64h，20%薯干粉搖瓶產酸13%，其檸檬酸純度明顯優于現有發酵菌。

郝捷應用低能離子注入誘變育種技術，對現有檸檬酸發酵菌進行改良，并改進了產檸檬酸高產菌的初篩方法。經過多次N+注入，在實驗室選育獲得了2株遺傳穩定的玉米原料發酵生產檸檬酸的高產菌株，其中HN-2004搖瓶發酵96h，平均產酸13.8%。盡管HN-2004的產酸比原始出發菌株提高了50%，但仍存在發酵周期長、糖酸轉化率低的問題。由此可見，使用單一的誘變因子往往很難達到預期的目的。王軍等在黑曲霉的育種中，首次嘗試了應用兩種核技術手段同時對黑曲霉進行誘變，并證實了采用60Co-γ輻照并復合N⁺注入方法的可行性，獲得了1株發酵周期72h、產酸13.68%、轉化率達103.45%的M3代菌株CN05。

離子注入是材料表面處理的通用技術，目前，運用離子注入進行作物品種改良已獲得了成功，目前可大致將離子注入分為能量沉積、動量傳遞、粒子注入和電荷交換等四個反應過程。其作用機制較為復雜，很難用單一模式解釋清楚。荷能離子注入除具有能量沉積引起機體損傷的特征外，還具有動能交換產生的級聯損傷，表現為遺傳物質原子轉移、重排或基因的缺失，還有慢化離子、移位原子和本底元素復合反應造成的化學損傷以及電荷交換引起的生物分子電子轉移造成的損傷。從離子注入的致死率曲線等可以看出，這種誘變手段在機理上有別于傳統方法。低能離子注入具有生理損傷小、突變率高等特點，能取得較高的正突變率。因此可將其用于動物和微生物的品種改良