[發(fā)明專利]一種輔助鑒定菜豆莢斑駁病毒的試劑及其應用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310122009.5
• 申請日: 2013-04-10
• 公開（公告）號: CN103173575A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發(fā)明（設計）人: 粟智平;鐘響;張靜;王穎;魯閩;楊益娥;耿金培
• 申請（專利權）人: 粟智平
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/94
• 代理公司: 煙臺雙聯專利事務所(普通合伙) 37225
• 代理人: 呂靜

技術領域

本發(fā)明涉及一種輔助鑒定菜豆莢斑駁病毒的試劑及其應用。

背景技術

菜豆莢斑駁病毒(Bean?pod?mottle?virus，BPMV),屬于豇豆花葉病毒屬(Comvirus)成員。1948年在Zaumeyer和Thomas首次報道，現已在美國、加拿大、巴西、秘魯、厄瓜多爾有分布，主要發(fā)生于美國東部和南部的大豆產區(qū)，并已向美國北部擴展蔓延。該病毒在中國無報道，是我國進境重要的檢疫性病毒種類之一。

BPMV寄主范圍為豆科，主要是菜豆和大豆。該病毒在菜豆生長期、花期、結莢期以及收獲后均可造成危害，主要癥狀是葉片出現黃色斑紋或者畸形，菜豆結莢數變少，豆粒的體積、重量和數量也都降低，從而造成菜豆產量大幅下降，同時種皮出現斑紋，種臍變色，嚴重降低萊豆的品質。該病毒單獨侵染大豆，可造成3-52.4%減產，若與大豆花葉病毒及擬莖點霉屬真菌復合侵染，產量損失可達60%以上。

該病毒的傳播介體主要是甲蟲，保毒期2～7天可種傳，但種傳率低，僅為0.1%。

BPMV的自然寄主在我國有較大面積種植，若BPMV隨進口大豆傳人我國并傳播，將會對我國的大豆生產造成不可估量的損失。鑒于此，開發(fā)先進的檢測技術，防止菜豆莢斑駁病毒傳入我國具有重要意義。

目前，檢測菜豆莢斑駁病毒國內外主要以免疫電鏡技術、酶聯免疫吸附測定（ELISA）和RT-PCR凝膠電泳技術為主，也有采用實時熒光PCR的研究報道，如RT-PCR凝膠電泳方法（韓芳，張穎濱，吳祖建等，菜豆莢斑駁病毒的RT-PCR檢測及其傳毒介體研究，西北農業(yè)學報[J]，2008，17（5）：94-97.）；RT-LAMP技術（聞偉剛，楊翠云，崔俊霞等，RT-LAMP技術檢測菜豆莢斑駁病毒的研究，植物保護[J]，2010，36（6）：139-141.）；實時熒光RT-PCR方法（易汪雪，陳舜勝，楊翠云等，單管實時熒光PCR方法同進檢測大豆種子中菜豆莢斑駁病毒和煙草環(huán)斑病毒，植物病理學報[J]，2011，41（1）：85-92.）。

電鏡技術設備昂貴，檢測靈敏度低；ELISA技術操作步驟繁瑣、檢測周期長、靈敏度低、易出現假陽性。PCR凝膠電泳技術較ELISA在多個方面有所提高，但易于造成污染。未見采用半巢式-RT-Realtime?PCR檢測BPMV的研究報道。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是提供一種輔助鑒定菜豆莢斑駁病毒的試劑及其應用。

本發(fā)明提供的輔助鑒定菜豆莢斑駁病毒的試劑，包括特異引物；所述特異引物由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成。

所述試劑可由所述特異引物和特異探針組成；所述特異探針的核苷酸序列如序列表的序列4所示。所述特異探針可為TaqMan探針。

所述試劑可用于制備輔助鑒定菜豆莢斑駁病毒的試劑盒。

本發(fā)明還保護一種輔助鑒定菜豆莢斑駁病毒的試劑盒，包括所述試劑。

所述試劑可用于輔助鑒定菜豆莢斑駁病毒。

本發(fā)明還保護一種輔助鑒定菜豆莢斑駁病毒的方法，包括如下步驟：以待測病毒的cDNA為模板，用特異引物對甲進行PCR，得到PCR產物甲；以待測病毒的cDNA為模板，用特異引物對乙進行PCR，得到PCR產物乙；如果PCR產物甲為188bp且PCR產物乙為87bp，待測病毒為候選的菜豆莢斑駁病毒；所述特異引物對甲為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的引物對；所述特異引物對乙為序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的引物對。

本發(fā)明還保護另一種輔助鑒定菜豆莢斑駁病毒的方法，包括如下步驟：以待測病毒的cDNA為模板，用特異引物對甲和特異探針進行實時熒光PCR，得到擴增曲線甲；以待測病毒的cDNA為模板，用特異引物對乙和所述特異探針進行實時熒光PCR，得到擴增曲線乙；根據擴增曲線甲和擴增曲線乙判斷待測病毒是否為候選的菜豆莢斑駁病毒；所述特異引物對甲為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的引物對；所述特異引物對乙為序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的引物對；所述特異探針為TaqMan探針，核苷酸序列如序列表的序列4所示。如果所述擴增曲線甲和所述擴增曲線乙均為陽性，待測病毒為候選的菜豆莢斑駁病毒。

所述待測病毒具體可為菜豆莢斑駁病毒、南方菜豆花葉病毒、花生矮化病毒、番茄環(huán)斑病毒、煙草環(huán)斑病毒或番茄斑萎病毒。

本發(fā)明還保護一種檢測待測樣本中是否含有菜豆莢斑駁病毒的方法，包括如下步驟：