[發明專利]實時熒光PCR中目的基因的表達量的校正方法

有效

• 申請號: 201310121958.1
• 申請日: 2013-03-26
• 公開（公告）號: CN103173559A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發明（設計）人: 朱礪;張順華;朱康平;李雪梅;李學杰;陳晨;洪蜜;袁紅敏;張宇;熊勇
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域：

本發明涉及實時熒光PCR中目的基因的表達量的校正方法，屬于分子生物學領域。

背景技術：

核酸擴增和檢測技術是當今生物學研究的重要手段之一。包括基礎科學、生物技術、醫學研究、法醫學、診斷學等在內的各領域的科學家們用這種方法進行廣泛的應用研究^[5]。對于某些應用，核酸定性檢測就可以滿足需求；而另外一些應用，要求進行定量分析。常規PCR中，擴增產物(擴增子)是通過終點法來分析檢測，即PCR反應結束后，DNA通過瓊脂糖凝膠電泳，然后進行成像分析。而熒光定量PCR可以在反應進行過程中進行累積擴增產物的分析和檢測，即“實時”。在反應體系中加入熒光分子，通過熒光信號的按比例增加來反應DNA量的增加，使PCR產物的實時檢測成為可能。滿足實驗目的的熒光化學物質包括DNA結合染料和熒光標記的序列特異引物或探針；專門的熱循環儀配備熒光檢測模塊，用于監測擴增時的熒光，檢測到的熒光信號反映了每個循環擴增產物的量。

相對常規PCR而言，熒光定量PCR的主要優點是準確地確定初始模板拷貝數和寬的動態范圍內和高的靈敏度。熒光定量PCR結果可以用于定性(判斷一段序列的有無)，也可以用于定量(確定DNA拷貝數)，即q-PCR，而常規PCR只能做半定量。另外，熒光定量PCR的結果無需通過瓊脂糖凝膠電泳來評估，大大節省實驗時間，提高實驗效率。還有，由于PCR反應和檢測都在反應管中進行，樣品污染的幾率大大降低，無需擴增后的實驗操作。

1996年熒光PCR技術首次由美國AppliedBiosystems公司推出，它是在總結PCR技術的的基礎上發展起來的實時定量技術。主要運用不可延伸的寡核苷酸雜交探針和cDNA結合，然后利用DNA聚合酶的5’-3’的外切活性將探針切斷，使探針由于能量傳遞結構的破壞而發出熒光。相對常規PCR而言，熒光定量PCR的主要優點是準確地確定初始模板拷貝數和寬的動態范圍內和高的靈敏度。熒光定量PCR結果可以用于定性(判斷一段序列的有無)，也可以用于定量(確定DNA拷貝數)，即qPCR，而常規PCR只能做半定量。另外，熒光定量PCR的結果無需通過瓊脂糖凝膠電泳來評估，大大節省實驗時間，提高實驗效率。還有，由于PCR反應和檢測都在反應管中進行，樣品污染的幾率大大降低，無需擴增后的實驗操作。

實時定量PCR(q-PCR)是基因表達分析中一種最常用的技術，能同時測定基因在不同組織中的表達量，而且只需要微量的初始樣本量。然而采用熒光定量技術研究基因的表達量需要對初始數據進行標準化，因為不同樣本間TotalRNA的初始含量是不同的(特別是在活體的組織中)，這是由于在RNA提取和cDNA合成過程中大量的誤差造成的。為了控制這些不是實驗設計造成的變異，看家基因被廣泛的使用。理想的看家基因是在不同的組織不同的階段能夠持續恒定的表達，且不受實驗處理的影響和在同樣的基因定量分析數據過程中能夠產生同樣的效應(即具有可重復操作性)。在之前試驗中看家基因的選擇往往是憑借經驗進行的，所選擇的看家基因在不同的組織或者不同的條件下能否穩定地表達并沒有經過驗證，容易造成最后分析結果的不準確，目前對mRNA的看家基因相關方面的評估已經引起關注和重視，已有大量的文章對此進行報道，其中包括豬的。由此可見，選擇一組可靠的看家基因數據對標準化定量數據至關重要的，如果選擇不正確會造成定量分析中的結論不準確。

在實時熒光PCR中，模板的定量有兩種方法：相對定量和絕對定量。相對定量指在一定樣品中靶序列相對于另一參照序列的量的變化。絕對定量指用已知的標準曲線來推算未知的樣本量。

絕對定量是通過樣品的CT值和標準曲線進行比較實現的。分析的結果是給定數量的樣品中(給定數量的細胞，每微克總RNA)中核酸的量(拷貝數、微克)。相對定量的分析結果是在相當量的試驗組(樣品A)和對照組(樣品B)中一個靶基因的相對比率(倍數差異)。絕對定量中，未知樣本的量(即拷貝數或單位數量)可以通過從已知量的標準品范圍中推算得出。為了建立標準曲線，需要已知濃度的模板。模板稀釋后，用這些稀釋樣品作為標準樣品，將未知的待測樣本和標準樣置于同一次實驗中進行反應，用稀釋的標準樣品構建標準曲線，通過推算來確定未知樣本中目的基因的量。這與用分子量標記來判定瓊脂糖凝膠上未知DNA條帶分子量大小的原理相似。