[發明專利]基于基因工程策略優化耶氏解脂酵母重組菌合成共軛亞油酸

有效

• 申請號: 201310120175.1
• 申請日: 2013-04-09
• 公開（公告）號: CN103233036A
• 公開（公告）日: 2013-08-07
• 發明（設計）人: 陳衛;張灝;張白曦;李敏;宋元達;陳海琴;趙建新;陳永泉;顧震南
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N1/19;C12P7/64;C12R1/645
• 代理公司: 北京君智知識產權代理事務所 11305
• 代理人: 田燕

技術領域

本發明涉及基因工程手段對耶氏解脂酵母重組菌進行優化從而提高共軛亞油酸產量，具體是對合成共軛亞油酸的重組耶氏解脂酵母菌株進一步優化。

技術背景

共軛亞油酸（Conjugated?linoleic?acid,CLA）是由一系列含有碳9、碳10、碳11開始的共軛雙鍵、具有位置和幾何異構的十八碳二烯酸構成的。近30年來，由于CLA具有包括抗癌、抗動脈粥樣硬化、免疫系統的調節以及抑制脂肪的積累等對人類健康有益的效果，而被廣泛的研究。c9，t11-CLA、t10，c12-CLA是含量最多并且是迄今為止確認具有生理活性功能的三種共軛亞油酸單體（還包括t9，t11-CLA）中的兩種。CLA存在于多種動、植物及人體組織中，特別是反芻動物乳制品中，但其含量較低。通過將紅花籽油或葵花籽油堿催化異構法等化學方法合成的CLA異構體的混合物，具有活性功能的異構體較難從中分離純化。而通過生物轉化法來獲得成分單一的功能CLA是目前的一個前沿技術，能夠滿足CLA在醫藥及營養領域的應用要求。

到目前為止，c9，t11-CLA生物合成的最高量是Delacroixia?coronata菌株通過delta-9脫飽和酶作用將t-亞油酸轉化成CLA，濃度最高達到10.5mg/ml。轉基因煙草種子以及大米中t10，c12-CLA占總脂肪酸的量僅分別為0.3%及1.6%。相對而言，生物合成t10，c12-CLA具有很大的提升空間。亞油酸異構酶（PAI）可以將游離亞油酸（LA）催化為共軛亞油酸。在之前我們的研究中通過優化PAI基因成功實現了在耶氏解脂酵母（Yarrowia?lipolytica，Y.lipolytica）重組菌株中的異源表達，并在重組菌株的脂肪酸組分中檢測到了產物t10，c12-CLA，利用多拷貝整合進一步提高了PAI基因在Y.lipolytica中的表達量及t10，c12-CLA產量，CLA產量占總脂肪酸量的5.9%。但此重組菌株的t10，c12-CLA產量還遠遠不能滿足實際應用的要求。在Y.lipolytica細胞中，LA不只是PAI的底物，它也會參與到脂肪酸貝塔氧化等代謝途徑中，這些途徑中的相關酶和PAI之間存在競爭關系，因此無論是PAI表達量的提高還是LA的增多都會使更多的LA流向CLA合成通路。來源于本實驗室高山被孢霉（Mortierella?alpine?ATCC32222，M.alpineATCC32222）的delta-12脫飽和酶基因（FADS12，d12）具有較廣的適配性，無論酵母還是絲狀真菌均能成為其表達宿主，delta-12脫飽和酶是將OA轉化為LA的脂肪酸脫氫酶，可進一步提高菌體內LA的含量。另外培養基中添加一些植物油也可使底物LA的含量大大提高。

所以本發明通過基因工程的方法來改造Y.lipolytica重組菌株，提高PAI基因表達量和底物亞油酸(LA)的含量，并且培養基中額外添加LA含量較高的大豆油，達到了用微生物法高產t10，c12-CLA的目標。

發明內容

本發明的目的是通過基因工程及發酵手段提高耶氏解脂酵母重組菌株中PAI的表達量以及底物LA的量，從而提高t10，c12-CLA專一異構體的產量。

本發明涉及含有opai/d12共表達基因的重組表達質粒，所述質粒可以是pJU16-opai-d12。

本發明另外一方面還涉及含有所述的重組表達質粒的宿主細胞，宿主細胞中包含的質粒可以是單拷貝或多拷貝的，例如1-8個拷貝，優選4個、5個、6個、7個或8個拷貝，最優選8個拷貝，所述宿主細胞可以是耶氏解脂酵母菌，例如CCFM-JUL系列菌，優選CCFM-JUL277。

本發明還涉及利用所述的重組表達質粒或所述的宿主細胞在生產共軛亞油酸中的用途，所述的共軛亞油酸是t10，c12-CLA，通過發酵所述宿主細胞，并在大豆油培養基中進行發酵可制備生產共軛亞油酸t10，c12-CLA專一異構體，具體發酵培養條件如下：CCFM-JU277-9菌株活化后，將種子液按5%接種量轉接至5LYN₂₀BDS培養基中，28℃發酵，發酵時間為30-45小時，優選的發酵時間為40小時。