[發明專利]反硝化細菌篩選鑒定試劑盒及篩選鑒定方法

有效

• 申請號: 201310115843.1
• 申請日: 2013-04-03
• 公開（公告）號: CN103194381A
• 公開（公告）日: 2013-07-10
• 發明（設計）人: 李博智;武震;宋文軍;魏紀平;朱高雄
• 申請（專利權）人: 天津市興源環境技術工程有限公司;天津清鑒生物科技有限公司
• 主分類號: C12M1/34
• 分類號: C12M1/34;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種反硝化細菌篩選鑒定試劑盒，其特征在于：它是由菌株富集管、反硝化鑒定預制管、菌株保藏液組成；其中:

菌株富集管：

菌株富集管為裝有富集培養基的螺口凍存管，其中每升富集培養基所含成分如下：牛肉膏1-3g，蛋白胨1-3g，葡萄糖0.8-2.1g，磷酸二氫鉀480-890mg，磷酸氫二鈉0.7-1.5g，硫酸鎂100-200mg，氯化鈣20-50mg，碳酸氫鈉20-120mg，微量元素母液A?1ml，微量元素母液B?1ml，以上培養基用濃度5%的碳酸鈉和HCl調pH至7.00-7.50；富集培養基配制完成并調完pH后，將富集培養基分裝到1.8ml螺口凍存管中，每支凍存管加入富集培養基1ml，分裝完畢后，115℃滅菌25-30min；

反硝化鑒定預制管：

反硝化鑒定預制管中裝有反硝化鑒定培養基，每升反硝化鑒定培養基所含成分如下：牛肉膏0.1-0.5g，蛋白胨0.1-0.5g，琥珀酸鈉1-3g，醋酸鈉0.1-0.8g，磷酸二氫鉀480-890mg，磷酸氫二鈉0.5-1.5g，硫酸鎂100-200mg，氯化鈣5-50mg，EDTA二鈉10-100mg，硝酸鉀1-2g，亞硝酸鈉0.1-1g，1%溴百里酚藍乙醇溶液1ml，微量元素母液A?1ml，微量元素母液B?1ml，以上培養基用濃度10%的氫氧化鈉和HCl調pH至7.00-7.50；反硝化鑒定培養基配制完成并調完pH后，將反硝化鑒定培養基分裝到反硝化鑒定預制管中，115℃滅菌25-30min；

菌株保藏液：

菌株保藏液成分如下：甘油40-60ml，去離子水40-60ml；，115℃滅菌25-30min；

其中：

每升微量元素母液A所含成分如下：硫酸亞鐵5g，EDTA二鈉5g；

其中：

每升微量元素母液B所含成分如下：?EDTA二鈉1.5g，ZnSO₄.7H₂O?430mg，CoCl₂.6H₂O?240mg，MnCl₂?629mg，CuSO₄.5H₂O?250mg，Na₂MoO₄.2H₂O?220mg，NiCl₂.6H₂O?190?mg，H₃BO₃?14mg。

2.如權利要求1所述的一種反硝化細菌篩選鑒定試劑盒，其特征在于：所說的反硝化鑒定預制管，包括鑒定管主體、氣體收集管、支撐桿、密封蓋和接種針頭；所說的鑒定管主體的頂部設有頂部管口，頂部管口與氣體收集管連接，所說的支撐桿自氣體收集管的頂部插裝于氣體收集管內，支撐桿的底部與氣體收集管的底部活動連接，鑒定管主體的底部設有底部管口，底部管口上安裝密封蓋，接種針頭的末端設有連接帽，與鑒定管主體底部管口連接。

3.如權利要求2所述的一種反硝化鑒定預制管，其特征在于：所說的支撐桿的底部設有密封外螺紋，與氣體收集管底部設置的密封內螺紋旋接。

4.如權利要求2所述的一種反硝化鑒定預制管，其特征在于：所說的氣體收集管上設有刻度。

5.如權利要求2所述的一種反硝化鑒定預制管，其特征在于：所說的支撐桿的底部密封外螺紋上方套裝密封橡膠墊。

6.如權利要求2所述的一種反硝化鑒定預制管，其特征在于：所說的支撐桿的頂部設有旋轉手柄。

7.如權利要求2所述的一種反硝化鑒定預制管，其特征在于：所說的鑒定管主體與氣體收集管為一體結構。

8.如權利要求2所述的一種反硝化鑒定預制管，其特征在于：所說的鑒定管主體、氣體收集管、支撐桿和接種針頭為PP或PE材料。

9.一種采用權利要求1反硝化細菌篩選鑒定試劑盒進行反硝化細菌篩選鑒定方法，其特征在于：?按如下的步驟進行：

步驟1：菌株富集

將待測菌樣接種到菌株富集管中，將菌株富集管蓋擰緊，培養條件選擇28-35℃溫度下靜止培養24-48小時，或將菌株富集管平放入搖床28-35℃、150-200rpm震蕩培養24-48小時；

步驟2：鑒定培養

將步驟1富集的菌株接種至反硝化鑒定預制管中，接種完畢后，在25-35℃條件下靜止培養；

步驟3：菌種保藏

向菌株富集管中殘留的菌液中加入0.5ml菌株保藏液，震蕩混勻，放入-20℃冰箱保存；

步驟4：結果觀察

步驟2的反硝化鑒定預制管中的菌株經培養12-48h后，記錄管中培養基的顏色變化和產氣量，此后，根據實驗需要，每隔一段時間連續記錄觀察結果，培養基顏色由綠色變成藍色并且有氣體產生，為反硝化陽性細菌。